松材线虫热激蛋白家族成员结构与功能分析

郝 昕，邓 振，陈 洁，刁 健，李 洋，王欣然，马 玲

（东北林业大学林学院，哈尔滨 150040）

松材线虫Bursaphelechusxylophilus引起的松树萎蔫病（又称松材线虫病）是世界森林生态系统中具有极大危险性和破坏性的森林病害。该病害对亚洲和欧洲的松林造成毁灭性破坏，对森林生态安全造成严重威胁。自 1982年在我国首次发现松材线虫至今，虽全力防治，但全国由于松材线虫引起的破坏仍造成了数十亿株松树的损失，造成的经济损失和生态价值损失更是高达千亿元[1,2]。截至2021年，松树萎蔫病已在全国19个省（自治区、直辖市）、742个县级行政区发生，占县级行政区总数的26.1%。累计发生面积180.92万hm2，同比上升62.40%，造成病死松树1407.92万株，并且表现出由点状分布向片状发展及向西和向北快速扩散的态势[3,4]。松材线虫对我国松林破坏巨大，严重影响我国的森林生态系统安全，阻碍了我国生态文明建设进程。

热激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是一类广泛存在于细菌、真菌和动植物中的蛋白质分子家族。当生物体暴露于高温时，就会通过热激发合成此种蛋白，以保护有机体自身。按照蛋白的质量大小，热激蛋白共分为五个亚族，分别为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 以及小分子热激蛋白（small Heat Shock Proteins，sHSPs）[5]。许多热激蛋白具有分子伴侣活性，可以协助细胞内分子组装和蛋白质折叠发挥功能[6]。在秀丽线虫Caenorhabditiselegans中的研究表明热激蛋白不仅可以调节生物体对环境的适应能力，延长生物体的寿命，还会激活生物体提高对重金属及药物的抗性[7,8]。因此HSP基因是近年来对生物耐热机制等研究最多的蛋白之一[9]。对松材线虫Bx-HSPs基因家族成员的研究有助于了解松材线虫的扩散机制，进而为宏观把控和防治松材线虫的扩散和蔓延提供理论指导。

本研究基于NCBI数据库中的秀丽线虫HSPs基因和相关文献，利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对松材线虫基因组数据，鉴定得到松材线虫中HSPs基因23个。利用生物信息学分析软件对获得的Bx-HSPs基因进行生物信息学特性分析，预测分析Bx-HSPs基因的具体功能。通过对Bx-HSPs基因特性及功能的具体分析，为研究松材线虫HSPs家族基因功能奠定基础，也为寻找潜在靶标基因，利用生物技术防治松材线虫病提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 Bx-HSPs基因家族成员进化关系及理化特性测定

为了解松材线虫Bx-HSPs家族成员信息，本研究从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载了秀丽线虫全部 HSPs基因。随后，以秀丽线虫 HSPs氨基酸序列作为检索序列在 Wormbase（https://wormbase.org）[10]上与松材线虫基因组[11]数据进行 BLAST比对，得到松材线虫 HSPs同源序列18个。加上文献已报道的5个松材线虫Bx-hsp基因Bx-hsp12（BXY_1656400.1）、Bx-hsp20（BXY_1035800.1）、Bx-hsp70（BXY_0013600.1）、Bx-hsp75（BXY_1666100.1）和Bx-hsp90（BXY_0009200.1），共23个HSPs基因[12,13]。

通过理化性质分析，可以为目标蛋白功能机制研究提供基础数据。在生物学中进化树用来表明物种之间的进化关系。通过进化树的构建，可以为预测目标蛋白的功能提供线索。应用蛋白分析（Expert Protein Analysis System，ExPASy）网站[14]中 ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）[15]对Bx-HSPs蛋白的理化性质，如氨基酸数、相对分子量、理论等电点、脂肪系数、分子结构式、原子总数、不稳定系数等进行分析。通过Clustal X将得到的松材线虫Bx-HSPs基因进行序列比对分析[16]，并通过CDD工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对Bx-HSPs保守结构域进行预测[17]，随后通过Mega 7软件中的邻位连接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育进化树，自展重复抽样检验1000次[18]。

1.2 蛋白质序列基序分析

通过MEME（https://meme-suite.org/meme/）方法对蛋白质序列的基序进行分析[19]，随后通过Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）[20]和 InterPro数据库（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）[21]获得基序注释信息。

1.3 疏水性和跨膜螺旋区域分析

蛋白质亲疏水性对蛋白的稳定性和功能具有重要的意义，而分析蛋白的跨膜结构域可以对目的蛋白属于何种功能蛋白做出研判，对预测蛋白的功能和作用有着重大意义。运用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）进行蛋白疏水性分析[22]，运用TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和PSORTb（http://www.psort.org/psortb/）预测蛋白质跨膜螺旋区（Transmem-Brane helical segments, TMHs）[23]。使用Protter网站（http://wlab.ethz.ch/protter/start/）对蛋白质的拓扑异构模型进行预测[24]。

1.4 磷酸化位点分析

蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。它与信号传导、细胞周期、生长发育等诸多生物学问题有着密不可分的关系，研究蛋白质磷酸化对阐明蛋白质功能具有重要的生物学意义。应用NetPhos 3.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[25]预测蛋白质磷酸化位点。分析丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点数量。

1.5 蛋白质的二级结构预测及三级结构建模

通过对预测结构的分析，可以解释酶的催化机理或预测蛋白质的突变位点，从而推断蛋白质结构与功能的关系。研究蛋白质的空间结构，有利于了解蛋白质的执行功能，确定蛋白质的结构对于生物学研究是非常重要的。本研究通过SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）预测Bx-HSPs蛋白质的二级结构[26]，运用 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对Bx-HSPs蛋白质的三级结构进行同源建模[27]。

2 结果与分析

2.1 Bx-HSPs基因家族的鉴定及理化性质分析

从松材线虫基因组中鉴定得到23个松材线虫Bx-HSPs基因家族成员（表1）。这23个松材线虫Bx-HSPs基因相对应的蛋白质氨基酸组成数量与相对分子质量具有显著性差异（表 2）。氨基酸组成数量为 111～770，平均氨基酸数量为373.91。相对分子质量为12631.16～88459.08，平均为42107.39。这些蛋白质的理论等电点为 4.67～8.89，脂肪系数为 47.01～97.92。由此可见，这些蛋白质的热稳定性发生了明显变化。蛋白质亲水性系数为-1.246～-0.101，蛋白质的亲水系数均为负值，表明上述23种热激蛋白均为疏水蛋白。这些蛋白质均由C、H、N、O和S五种原子组成。原子总数为1766～12464个不等。蛋白不稳定系数区间为26.22～62.90，共有12个蛋白质的不稳定系数大于40，其中有9个为小热激蛋白，表明小热激蛋白结构不稳定可能性更高，而其他11种蛋白质的系数小于40，其中有6个预测结果为HSP70，表明HSP70 的结构更稳定。

表1 Bx-HSPs家族成员与秀丽线虫HSPs家族成员对照表Table 1 Comparison table of Bx-HSPs and Ce-HSPs

表2 Bx-HSPs家族成员蛋白质理化性质分析结果Table 2 Results of physicochemical properties of Bx-HSPs

2.2 系统发育进化树及蛋白质基序

通过构建 NJ系统发育进化树（图 1）初步揭示了松材线虫 HSPs家族成员的系统发育进化关系，以bootstrap多重采样检测作为结果的可靠性基础。由表3可知，与预期相同，Bx-HSPs 家族蛋白质，特别是那些具有相似进化关系的蛋白质，均含有相同或相似的蛋白质基序。通过MEME对序列的详细分析，得到了15个保守的蛋白质序列基序（图2）。随后，通过Pfam和InterProScan对蛋白质基序进行分析，结果表明，基序8和基序9为HSP20结构域，其他基序为HSP70结构域。

图1 Bx-HSPs家族成员系统进化发育树Fig.1 Phylogenetic tree of Bx-HSPs.

图2 Bx-HSPs家族成员蛋白质基序示意图Fig.2 The motifs analysis of Bx-HSPs

表3 Bx-HSPs家族成员蛋白质基序分析Table 3 The motifs analysis of Bx-HSPs.

根据 Pfam 和 InterProScan分析各蛋白质序列结构可知，BXY_0210400.1、BXY_1656600.1、BXY_HSP12、BXY_0289500.1、BXY_1365700.1、BXY_1274600.1、BXY_0957900.1、BXY_0586000.1、BXY_0165400.1、BXY_0750300.1、BXY_1552700.1和BXY_ HSP20为small HSP亚家族成员，而BXY_1563600.1、BXY_0768000.1、BXY_0640100.1、BXY_0312700.1、BXY_1651000.1、BXY_1076000.1、BXY_0218300.1、BXY_0318200.1、BXY_HSP70为HSP70亚家族成员。随后对没有通过MEME分析得到蛋白质基序的BXY_HSP75和BXY_HSP90进行Conserved Domains Search分析研究发现，这两个蛋白属于HSP90亚家族成员。

2.3 Bx-HSPs家族成员蛋白质疏水性和跨膜螺旋区分析

蛋白质疏水性分析结果以BXY_1563600.1为例对Bx-HSPs家族成员蛋白质疏水性分析结果进行说明。BXY_1563600.1蛋白中的第531位精氨酸（R）具有-3.944的低疏水性评分，由此可知它具有很高的亲水性。相反，第395位的天冬氨酸（D）具有2.022的较高疏水性得分，表明其更具有疏水性。表4中列出了该家族氨基酸序列的疏水性分析结果，由该结果可知，该家族中的蛋白质包含多个亲水性和疏水性区域，但是他们的分布和聚集现象并不显著。而通过TMHMM和PSORTb对蛋白质序列分析发现，该家族成员除BXY_1076000.1和 BXY_HSP90存在跨膜结构外，其余家族成员均属于胞内蛋白。

表4 Bx-HSPs家族成员蛋白质疏水性分析Table 4 Protein hydrophobicity analysis of Bx-HSPs

2.4 拓扑异构模型预测

蛋白质糖基化修饰除了影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，还在分子识别、细胞通信、信号转导等生物过程中发挥着重要的作用，因此糖基化位点分析具有十分重要的意义。Bx-HSPs家族成员蛋白质拓扑结构分析结果表明（表5），该家族蛋白质结构上含有0～7个N-糖基化位点。其中BXY-HSP70具有最多的N-糖基化位点个数，共计有7个。研究表明，N-糖基化位点的存在对于蛋白质的折叠和运输非常重要。因此，该预测结果可以从另一个角度证实Bx-HSPs家族成员的分子伴侣特性。

表5 Bx-HSPs家族成员蛋白质拓扑结构分析Table 5 Protein topological structure analysis of Bx-HSPs

2.5 二级结构分析及三级结构建模

蛋白质的二级结构包含局部残基之间由氢键所调节的相互作用。最普遍的二级结构就是α-螺旋及β-折叠，此外还有β-转角和无规卷曲。Bx-HSPs家族成员二级结构分析结果表明（表6），Bx-HSPs家族成员α-螺旋占比为15.00%～58.61%，其中sHSPs的成员α-螺旋占比均小于40%；Bx-HSPs家族成员β-折叠占比为10.93%～27.93%；Bx-HSPs家族成员β-转角占比为2.46%～12.90%；Bx-HSPs家族成员无规卷曲占比为27.21%～55.00%，其中sHSPs的成员无规卷曲占比均大于40%。三级结构建模结果表明（图3），Bx-HSP70亚家族、Bx-HSP90亚家族及Bx-sHSP亚家族三级结构有明显的形态学区别，因此执行着不同的生物学功能。

表6 Bx-HSPs家族成员中构成蛋白质二级结构的氨基酸数量分析Table 6 The number of amino acids that constitute the secondary structure in BX-HSPs.

图3 Bx-HSPs家族成员三级结构分析Fig.3 The results of tertiary structure by Swiss-MODEL.

3 讨论

松材线虫是世界多国公认的外来入侵生物，由其引起的松树萎蔫病导致松属和杉属等针叶树种植物大量萎蔫死亡，危害极其严重[28]。随着社会的进步和发展，人类活动对自然界的影响日益加剧，而如松材线虫等外来生物的入侵风险也日益受到广泛关注[29]。外来生物发挥自身潜能是在新环境下形成入侵和扩散的关键[12]。本研究从生物信息学水平上分析热激蛋白家族成员结构与功能，为今后进一步在分子水平上开展松材线虫对温度适应性的研究打下了基础。

本研究对松材线虫Bx-HSPs家族成员进行了多种形式的生物信息学分析。首先运用ProtParam工具对Bx-HSPs家族成员的理化性质进行分析，为目标蛋白功能机制研究提供基础数据。随后运用邻接法（NJ method）构建了Bx-HSPs家族成员的系统发育进化树，从而比较Bx-HSPs家族中各成员的序列相似性。由于亲疏水性在蛋白质结构和功能中起着至关重要的作用，因此本研究通过对蛋白质疏水性分析，分析了 Bx-HSPs家族成员的结构特点。N－糖基化位点的数量对蛋白质的折叠和运输起着重要作用，因此本研究对Bx-HSPs家族成员拓扑结构进行了分析，结果证明了Bx-HSPs家族成员的分子伴侣特性。

截至目前，尽管有研究指出松材线虫HSPs家族成员中有部分基因的变化使线虫表现出对温度改变的适应性，但还没有关于松材线虫HSPs家族成员系统化报道。本研究的结果分析了松材线虫HSPs家族成员调控线虫响应温度适应性的结构基础。而该家族基因调控松材线虫响应温度适应性的调控机制还有待后续研究进行进一步探索与发现。本研究的目的在于为探索松材线虫扩散的分子机制提供基础，从而为松材线虫的预测预报提供理论支持。