心房颤动病人血浆外泌体miR-320d表达与心房纤维化程度及复发的关系

周晓兰，杨 帆，徐大春，黄建飞，卢 毅，刘建云

心房颤动是一种常见的心律失常，且发病率逐年升高，病人致死率和致残率增加。有研究显示，心房颤动的发生和维持与心房病理生理改变密切相关，主要表现为心房重构，心房纤维化是结构重构的主要特征[1]。心房纤维化是指细胞外基质中胶原含量增加或(和)胶原成分发生改变，特征为心脏成纤维细胞合成增加，细胞外基质蛋白过度沉积，导致心肌细胞外基质纤维化[2]。近年来，导管射频消融术已成为治疗心房颤动的重要方法，但病人术后复发率较高，需要再次消融比例为20%～30%[3]。miRNA是一类在生物进化上高度保守的内生性小分子单链RNA，近年来多种miRNA被发现在心房颤动病人心房纤维化过程中异常表达，且与心房纤维化程度有关。miR-320d是miR-320家族中的一员，近年来对miR-320家族的研究逐渐增多，胶质瘤组织和细胞系中miR-320d表达显著降低，过表达miR-320d可抑制癌细胞生长、迁移和侵袭[4]。

B细胞淋巴瘤病人低表达miR-320d提示有较短的生存期[5]。miR-320d与癌症关系的研究较多，但对心肌细胞的影响较少，外泌体是细胞外囊泡中的一种亚群，可在心肌细胞间充当信号转导分子，近年来外泌体在心血管系统中的作用越来越受到重视。本研究检测心房颤动病人血浆外泌体miR-320d表达水平，分析miR-320d与心房颤动病人心房纤维化程度及复发的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月—2020年7月南通市第六人民医院收治的心房颤动病人108例作为研究组，其中男57例，女51例，年龄(56.13±10.02)岁；选取同期入院体检的健康体检者100名作为对照组，其中男52名，女48名，年龄(55.43±8.94)岁。病人纳入标准：入院时行标准12导联心电图诊断为心房颤动；既往无心房颤动消融术病史；临床资料完整；所有病人均知情同意，并签署知情同意书。排除标准：合并急性或终末期肝病、严重慢性阻塞性肺疾病、急性冠脉综合征；合并恶性肿瘤；合并甲状腺功能异常等自身免疫性疾病；安装起搏器病人，严重心动过速或心动过缓。

1.2 研究试剂与仪器 Serum/plasma micro kit试剂(博奥派克，货号：555000)、逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司生产，货号：TR102-01/02)、Ⅰ型胶原羧基端前肽(PⅠCP)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司生产，货号：EH0957)、Ⅲ型前胶原多肽(PⅢNP)ELISA试剂盒(上海鑫乐生物科技有限公司生产，货号：xl-Eh0453)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)ELISA试剂盒(南京赛鸿瑞生物科技有限公司生产，货号：SEA097Ov02)。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集与保存 采集所有研究对象空腹静脉血4 mL，使用含EDTA-K2的真空采血管抗凝，以3 000 g离心5 min，分离血浆，将分离后的血浆转移至无菌无酶的EP管中，置于-80 ℃保存。使用外泌体提取试剂盒提取血浆标本中的外泌体，用于RNA提取。

1.3.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测血清miR-320d水平 通过miRNeasy serum/plasma micro kit(博奥派克，美国)试剂提取血浆外泌体RNA，所有步骤均在冰上操作，预防RNA降解。采用试剂盒检测血浆外泌体中miR-320d表达水平，取1 μg RNA按照cDNA逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应合成cDNA，加入SYBR Green PCR Master Mix进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s变性；60 ℃ 1 min退火延伸，45个循环进行扩增，每个样品重复3次，以U6作为内参，以2-△△ct计算miR-320d的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.3.3 超声心动图 采用多普勒超声诊断仪对研究对象行心脏超声心动图检查，包括左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左房内径(left atrial diameter，LAD)及左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.3.4 心房纤维化血清标记物 采用ELISA检测所有研究对象心房纤维化血清生化标记物PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平，具体操作按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自美国R&D Systems公司。

1.3.5 心房纤维化程度 按照心房颤动相关指南[6]中的环肺静脉电隔离导管射频消融术原则及方法，在CARTO-3三位标测系统下构建左房和各肺静脉口三维电解剖图，记录左房前壁、后壁、顶部和间隔部电压，重建左房电压图。记录接触压力标测图(采点压力5～10 g)，术中连续记录肺静脉等腔内点位，消融导管阻抗、温度、功率等，在CARTO-3标测系统指导下实时显示消融导管的接触压力(CF)，导管消融阈值为最大移动稳定范围2 mm，最小时间3 s，最小压力6 g，常规设置FT1>300 g·s进行标测。消融顺序：按照左侧肺静脉环形消融、右侧肺静脉环形消融、左房顶部线及二尖瓣峡部线消融、验证房顶线阻滞；定义正常心内膜电压振幅>1.5 mV，心内膜低电压<0.5 mV区域为CARTO图像纤维化区域，根据CARTO左心房点解剖图像，中线及二尖瓣将前后壁分为8个象限，≤2个象限出现低血压为轻度心房纤维化，≥3个象限出现低电压为重度心房纤维化。

1.3.6 随访 采取门诊复查方式对病人进行随访，随访时间为12个月，复查心脏彩色超声心动图及24 h动态心电图，根据复查结果将心房颤动病人分为复发组(44例)和未复发组(64例)。

2 结 果

2.1 研究组和对照组血浆外泌体miR-320d表达与心功能指标比较 与对照组比较，研究组血浆外泌体miR-320d表达水平和LVEF降低，LAD增加，差异有统计学意义(P<0.001)。详见表2。

表2 研究组和对照组血浆外泌体miR-320d表达与心功能指标比较(±s)

2.2 血浆外泌体miR-320d表达水平与心房纤维化的关系 根据心房颤动病人血浆外泌体miR-320d表达水平分为miR-320d高表达组(56例)和miR-320d低表达组(52例)。与miR-320d高表达组比较，miR-320d低表达组心房纤维化程度、PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平升高，差异有统计学意义(P<0.001)。详见表3。

表3 不同血浆外泌体miR-320d表达水平病人心房纤维化指标比较

2.3 不同复发情况病人临床资料比较 复发组高血压、重度心房纤维化比例高于未复发组(P<0.01)，miR-320d表达水平低于未复发组(P<0.001)，差异有统计学意义。详见表4。

表4 不同复发情况病人临床资料比较

2.4 心房颤动病人术后复发的影响因素分析 Logistic回归分析结果显示：高血压、重度心房纤维化、miR-320d水平是心房颤动病人术后复发的危险因素(P<0.05)。详见表5。

表5 心房颤动病人术后复发的影响因素分析

2.5 血浆外泌体miR-320d对心房颤动复发的预测价值 ROC结果显示，miR-320d预测心房颤动病人术后复发的ROC曲线下面积(AUC)为0.799，95%CI[0.716，0.881]，灵敏度为77.3%，特异度为70.3%。详见图1。

图1 miR-320d对心房颤动复发诊断价值的ROC曲线

3 讨 论

心房颤动是全球范围内常见的心律失常，确切的发病机制复杂，心房纤维化、氧化应激等均是心房颤动发生的相关因素[7]。持续的心房颤动可能引起心房结构改变，如心房心肌肥大、细胞排列紊乱及心肌间质纤维化等，称为心房结构性重构，最终导致心房扩大[8]。心房纤维化作为心房结构重构的标志性改变，是心房颤动发生和维持的基础，结缔组织纤维化过程包括纤维成分变化和重新分布，心肌实质细胞凋亡和被替代，这一过程既是对受损伤部位的修复过程，也是调节心肌几何结构适应新的生理功能状态，减少新的机械、化学及电刺激过程[9]。心房颤动病人心房纤维化可增加远期心脑血管病复发风险[10]，因此，对心房纤维化程度的判断可预测心房颤动复发。

miR-320d属于miR-320家族成员，定位于13号染色体(13q14.11)，miR-320家族编码基因较少发生变异[11]。有研究表明，其与多种肿瘤有密切关系，miR-320在一些肿瘤中可抑制肿瘤发生发展，但在某些肿瘤中又促进肿瘤生长[12]。有研究显示，miR-320b是颈动脉粥样硬化和易损斑块的特异性血清标志物[13]。miR-320d已证实是主动脉夹层的生物标志物，可调节血管平滑肌细胞凋亡[14]。另有研究证实，miR-320d在心房颤动小鼠中表达降低，其低表达与心房颤动心肌细胞凋亡有关[15]。

本研究结果显示，与对照组相比，研究组血浆外泌体miR-320d表达水平、LVEF降低，LAD增大。提示血浆外泌体中miR-320d可能参与心房颤动发生，且心房颤动病人LAD增大，左心房增大，存在心房纤维化。同时结果显示，与miR-320d高表达组相比，miR-320d低表达组心房纤维化程度、PⅠCP、PⅢNP、MMP-1水平升高。提示miR-320d低表达与重度心房纤维化有关，心房纤维化血清生物标志物水平升高提示心房纤维化程度加重，miR-320d可抑制心肌细胞凋亡，其低表达引起心肌细胞凋亡增加，细胞活力降低，参与心房纤维化的发展过程。复发组高血压、重度心房纤维化比例高于未复发组，miR-320d表达水平低于未复发组，提示miR-320d水平与病人预后有关，miR-320d低表达、高血压、重度心房纤维化可能提示心房颤动病人术后复发高风险。Logistic回归分析结果显示：高血压、重度心房纤维化、miR-320d水平是心房颤动病人术后复发的危险因素，表明miR-320d低表达与预后不良密切相关，应关注miR-320d低表达、高血压及重度心房纤维化病人预后情况。ROC结果显示：miR-320d诊断心房颤动病人术后复发的AUC为0.799，灵敏度为77.3%，特异度为70.3%，提示血浆外泌体miR-320d表达水平对心房颤动病人术后复发具有一定预测价值，可作为预测心房颤动病人术后复发的潜在生物学标志。

综上所述，心房颤动病人血浆外泌体miR-320d呈低表达，miR-320d低表达与重度心房纤维化及病人术后复发有关，是心房颤动复发的危险因素，miR-320d对心房颤动病人术后复发具有一定预测价值，可作为预测病人预后的潜在生物学标志。本研究存在不足，对miR-320d分子层面的作用机制尚未涉及，仍需进一步进行深入探讨。