肥料配施对北苍术3种倍半萜类成分及2种生物合成关键酶基因表达的影响

王孟聪，翁丽丽，孙 金，肖春萍，陈天丽

肥料配施对北苍术3种倍半萜类成分及2种生物合成关键酶基因表达的影响

王孟聪，翁丽丽，孙 金，肖春萍*，陈天丽*

长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117

探讨不同肥料配施对北苍术(DC.) Koidz. 3种倍半萜成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇含量及2种生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy- 3- methylglutarate monoacylase A reductase，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）活性及基因表达的影响。在不同的肥料配施下，采用高效液相色谱法测定北苍术3种倍半萜类成分的含量，采用试剂盒法（双抗体夹心法）测定北苍术根茎中HMGR和FPPS的活性；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定北苍术HMGR和FPPS的表达量；采用SPSS软件对生物合成关键酶活性和基因表达量进行相关性分析。适宜的氮磷钾配施，可促进北苍术倍半萜类成分的积累，并显著提高其生物合成关键酶活性及基因表达。该试验区所代表的土壤肥力状况下有利于倍半萜类成分积累的最优施肥方案为氮肥（N）180 kg/hm2，磷肥（P2O5）225 kg/hm2，钾肥（K2O）105 kg/hm2。不同肥料配施下，关键酶基因HMGR与苍术酮、β-桉叶醇呈显著正相关（＜0.05）；关键酶基因FPPS与白术内酯II、β-桉叶醇呈极显著正相关（＜0.01），与苍术酮显著相关（＜0.05）。优化氮磷钾配施对北苍术倍半萜类成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇积累及生物合成关键酶HMGR和FPPS活性及基因表达作用显著，北苍术根茎中倍半萜类成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇的生物合成受到多种基因及酶的调控，其中关键酶FPPS发挥了较大的调控作用。

北苍术；肥料配施；倍半萜；3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶；法呢基焦磷酸合酶；基因表达；白术内酯II；β-桉叶醇；苍术酮

北苍术(DC.) Koidz.为菊科多年生草本植物，以干燥根茎入药[1]。倍半萜类成分是苍术属植物主要化学成分，主要包括苍术酮、白术内酯II、苍术苷A、β-桉叶醇等，具有抗炎、抗肿瘤、保护神经系统、保肝、抗菌、抗病毒等广泛的药理作用，此类成分的提高对于北苍术药材质量的控制意义重大[2-4]。研究表明[5-8]，倍半萜类成分多数通过甲羟戊酸途径在植物体内合成，3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）是倍半萜类化合物生物合成途径的关键酶和限速酶。HMGR对MVA途径起催化作用，FPPS催化倍半萜化合物的前体化合物法呢基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）的合成[9-10]。药材质量与土壤中营养成分组成等密切相关，氮、磷、钾是植物生长发育过程中的重要营养元素，合理配施可以引起植物有效成分性质或含量的变化，孙金等[11]研究发现科学合理的氮、磷、钾配施可以促进北苍术生长和北苍术中倍半萜类成分含量的增加，但目前针对肥料配施对北苍术中倍半萜类成分生物合成影响的研究较少，作用机制尚不明确。因此，本研究以北苍术为材料，研究不同肥料配施下北苍术根茎中苍术酮、白术内酯II、β-桉叶醇3种倍半萜类成分含量以及关键酶HMGR和FPPS活性和基因表达量，分析北苍术倍半萜类与关键酶活性及基因表达之间的关系，为阐明肥料配施对北苍术倍半萜类成分合成的分子调控机制，提高北苍术倍半萜类成分含量和品质奠定理论基础，并为北苍术种植过程中合理的肥料配施提供理论依据。

1 材料

1.1 试验区概况及供试材料

选择前茬作物为玉米的地块作为试验田，具体位置位于吉林省柳河县安口镇北苍术种植基地，地理位置125°36′4.94″E，42°12′37.65″N，海拔399 m。对土壤情况进行测定：土壤pH为5.65、有机质含量为51.73 g/kg、速效氮、有效磷、速效钾含量分别为41.89、94.40、143.54 mg/kg。选取长势相近，叶茎完好，无病虫害，植株健壮，根系发达的一年生北苍术苗作为供试材料移栽试验田，由吉林省昌农实业集团有限公司柳河北苍术栽培基地提供。经长春中医药大学中药资源与鉴定教研室翁丽丽教授鉴定为北苍术(DC.) Koidz. 正品。试验中尿素（N，总氮≥46%）、过磷酸钙（P2O5，总磷≥46%）、硫酸钾（K2O，总钾≥50%）为试验用肥料。

1.2 试剂

对照品苍术酮（批号P11M10F73437，质量分数≥97.3%）、β-桉叶醇（批号P24O8F46474，质量分数≥99.4%）、白术内酯II（批号M22A10S95762，质量分数≥99.9%）均购于上海源叶生物科技有限公司。磷酸、乙腈为色谱纯；甲醇分析纯；水为超纯水。植物通用总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司）。植物HMGR ELISA检测试剂盒、植物FPPS ELISA检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 试验设计

参考依据北苍术种植基地对北苍术的多年种植实践经验，对本实验的施肥种类和施肥时间进行设置。采用L9(34)正交试验设计优化设置施肥方案[11]，设置氮、磷、钾3个因素，4个水平，正交试验方案见表1。设置10个不同的施肥处理，3次重复，30个小区，小区总面积150 m2，每个小区3 m2（1.5 m×2.0 m），行株距为15 cm×20 cm，每个小区栽种100株北苍术。北苍术植株于2019年5月25日移栽，移栽前无任何施肥，后期除肥料按设计施用外，其他田间管理措施一致。

表1 L9(34)正交试验设计的施肥种类和施肥量

Table 1 Fertilization types and fertilization amount of orthogonal experiment L9(34)

处理组合施用量/(kg·hm−2) 尿素（N）过磷酸钙（P2O5）硫酸钾（K2O） T0N0P0K0 0 0 0 T1N1P1K1 90 75105 T2N1P2K2 90150210 T3N1P3K3 90225315 T4N2P1K2180 75210 T5N2P2K3180150315 T6N2P3K1180225105 T7N3P1K3270 75315 T8N3P2K1270150105 T9N3P3K2270225210

5月下旬（苗期）施入基肥，N肥60.0%、P肥100.0%、K肥33.3%，N、P、K比例为6∶8∶4；6月下旬（营养生长期）和8月下旬（果期）分别进行1、2次追肥处理，其中N肥20.0%、K肥33.3%，N、K比均为2∶4。将不同处理组合的氮磷钾肥用相同体积自来水溶解，均匀喷施于小区土壤表面。

2.2 样品的收集

移栽北苍术种苗前，随机选取其中的200株测定其生长指标，计算其各指标平均值则为基础生物量。取样时间是种苗移栽后的第30、60、90、120、150 d，在每个平行小区随机取样6株，将取样后的北苍术装入冰盒带回实验室，将样品除去地上部分和须根后进行清洗，吸水纸吸干附着水分，其中一部分根茎样品进行分装、液氮固定，储存于−80 ℃冰箱备用，另一部分洗净后室内阴干，干燥后粉碎过筛备用。

2.3 含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取白术内酯II、β-桉叶醇、苍术酮适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度为10.1、33.0、53.4 μg/mL的混合储备液，备用。

2.3.2 供试品溶液的制备 将处理后的北苍术药材粉碎过三号筛，精密称定0.3 g，参照《中国药典》2020年版一部苍术项下含量测定方法，制备供试品溶液。

2.3.3 苍术酮、白术内酯II、β-桉叶醇含量测定 色谱条件参照本课题组前期建立的北苍术一测多评方法[6]。

2.3.4 线性回归方程的绘制 精密量取“2.3.1”项下混合储备液逐级稀释成系列浓度（分别为原浓度的1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025倍），取15 μL注入高效液相色谱仪。以峰面积为纵坐标（），质量浓度为横坐标（），进行线性回归，回归方程见表2。

表2 3种对照品回归方程和线性范围

Table 2 Regression equations and linear ranges of three reference substances

成分回归方程r线性范围/μg 苍术酮Y＝18 717.410 7 X＋1 756.575 80.999 70.020 0～0.801 0 白术内酯IIY＝47 177.499 2 X＋483.693 00.999 90.003 8～0.151 5 β-桉叶醇Y＝30 772.658 2 X＋4 034.467 60.999 50.012 4～0.495 0

2.4 关键酶活性测定

称取北苍术根茎0.2 g，加入1.8 mL预冷的0.01 mol/L PBS（pH 7.4，NaCl 8 g、Na2HPO41.44 g、KH2PO40.24 g），液氮研磨成匀浆，4 ℃下10 000 r/min离心20 min。采用试剂盒法（双抗体夹心法）测定不同肥料配施下北苍术根茎中关键酶HMGR和FPPS的活性，操作步骤按照试剂盒内说明书进行，2种关键酶HMGR标准曲线及测定范围分别为＝0.030 5＋0.075 4，＝0.999 1，线性范围为0～80 U/L；FPPS标准曲线＝0.004 8＋0.038 2，＝0.999 5，线性范围为0～400 U/mL。

2.5 关键酶基因表达量测定

2.5.1 植物总RNA的提取与cRNA的合成 根据Takara植物通用总RNA提取试剂盒说明书提取北苍术根茎总RNA，采用Multiskan Sky全波长酶标仪测定样品RNA浓度及纯度，并将其反转录成cDNA，−20 ℃储存，备用。

2.5.2 引物设计与合成 以EF-1α为内参基因[12]，根据试验样品中转录组筛选出的HMGR和FPPS基因片段，由上海生工设计合成引物，引物序列见表3。

2.6 引物特异性检测

2.6.1 北苍术内参基因及关键酶基因实时荧光定量PCR熔解曲线 以北苍术根茎中cDNA为模板，阴性（NTC）为对照进行实时荧光定量PCR，所得熔解曲线见图1，结果表明EF-1α、HMGR和FPPS均为特异性单峰，空白对照无扩增，且没有引物二聚体及非特异性扩增干扰，说明本实验引物具有较高的特异性，符合试验要求。

表3 实时荧光定量PCR引物

Table 3 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

基因TRINITY引物序列（5’-3’）产物长度/bp EF-1α 正向ACCAACTGGGTTGACAACTGAAGT 64 反向AGCCTCGGTAAGGGCTTCAT HMGRDN14568正向AACCGCCACCACTCACTCACATTCTTC109 反向GGACGCCGTTGCTTCTGGAC FPPS 正向TCTTGCGTGTGCCCTTGGTTG206 反向TGACCTCTGCGTGTATGGGACTC

A-EF-1α基因 B-HMGR基因 C-FPPS基因

2.6.2 北苍术内参基因及关键酶基因实时荧光定量PCR扩增曲线与扩增效率 进行实时荧光定量PCR扩增，结果发现以5倍梯度稀释北苍术根茎组织cDNA后，得到的扩增曲线平滑，指数扩增期明显，得到的北苍术内参基因和关键酶相关基因和的相对定量标准曲线见图2，其相关系数及扩增效率符合试验要求，表明该方法的准确性和重复性较好。

2.6.3 实时荧光定量PCR扩增 以cDNA为模板，根据表2中各基因的引物序列，按照20 μL反应体系（SYBR®Premix ExTM10.4 μL，10 μmol/LForward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL）及反应程序[95 ℃预变性30 s；40个循环（95 ℃变性5 s，64 ℃退火1 min）]对不同肥料配施下北苍术和基因表达量进行测定，每个样品3个生物学重复。RT-PCR反应内参基因为。

A-EF-1α基因 B-HMGR基因 C-FPPS基因

2.7 数据处理

使用Excel 2019进行试验数据的换算和预处理，计算实时荧光定量PCR结果采用2-△△Ct法[13]进行；数据分析、各参数之间的多重比较及图形绘制等利用SPSS 21.0、GraphPad prism 6.0、Photoshop CC 2018进行。

3 结果与分析

3.1 肥料配施对北苍术3种倍半萜成分含量的影响

3.1.1 肥料配施对北苍术苍术酮含量的影响 北苍术种苗基础苍术酮质量分数为（1.807 4±0.042 1）mg/g。由图3可知，不同肥料配施下，不同方案的北苍术根茎中苍术酮含量在移栽的30～120 d时期整体呈现下降的趋势，质量分数0.968 8～5.249 3 mg/g。移栽150 d时，各方案下的苍术酮含量呈现上升的趋势，质量分数在1.355 4～4.525 2 mg/g。T4施肥方案各个时期的苍术酮含量与同时期其他组相比，处于较高水平，特别在移栽150 d时，苍术酮含量明显较高，质量分数达到4.525 2 mg/g，是空白组（T0）的1.51倍。综合分析，采用T4施肥方案，北苍术根茎中苍术酮含量会达到较高水平，说明该施肥方案能够有效促进倍半萜类成分代谢，增加苍术酮的合成与积累。

不同字母表示差异性显著，P＜0.05，下同

3.1.2 肥料配施对北苍术β-桉叶醇含量的影响 北苍术种苗基础β-桉叶醇质量分数为（2.948 8±0.095 8）mg/g。由图4可知，不同肥料配施下，不同方案北苍术根茎中β-桉叶醇在30～150 d呈现下降趋势，移栽30 d的β-桉叶醇范围在2.491 5～5.180 5 mg/g。比较各方案30～120 d各个时期北苍术根茎中β-桉叶醇量，T6方案相对较高，在60、90、120 d的β-桉叶醇质量分数分别达到1.013 2、0.817 8、1.388 1 mg/g，是空白组T0的1.35、3.91、8.74倍。移栽150 d较前一时期整体呈上升趋势，T6方案仍然处于较高水平，β-桉叶醇质量分数为0.963 3 mg/g，是空白组的1.76倍。由此可知，T6方案北苍术根茎中的β-桉叶醇含量在发育期较高，表明不同肥料配施的比例可能发挥相似的协同作用，实际生产过程中可以通过调控肥料的用量和配比降低农业生产成本。

3.1.3 肥料配施对北苍术白术内酯II含量的影响 北苍术种苗基础白术内酯II质量分数为（0.275 7±0.001 7）mg/g。由图5可知，不同肥料配施下，北苍术根茎中白术内酯II的含量变化趋势与β-桉叶醇相似，不同方案下的北苍术根茎中白术内酯II含量在移栽30～150 d时期整体呈现下降的趋势。移栽30 d时的北苍术根茎中白术内酯II质量分数在0.449 2～0.783 7 mg/ g，其中T6施肥方案下的白术内酯II质量分数为0.738 6 mg/g，与其他组相比相对较高。综合移栽30～150 d各个时期，T6方案相对其他方案白术内酯II含量处于较高水平，在30、60、90、120、150 d的白术内酯II质量分数分别为0.738 6、0.607 5、0.461 0、0.445 3、0.638 5 mg/g，是空白组的1.30、1.89、1.08、1.53、1.58倍。综合上述分析，T6方案施肥下北苍术根茎中的白术内酯II含量在发育期较高，证明该施肥方案可以促进倍半萜类成分的合成与积累。

图4 不同氮磷钾配施对北苍术中β-桉叶醇含量的影响()

图5 不同氮磷钾配施对北苍术白术内酯II含量的影响()

3.1.4 不同肥料配施下北苍术最佳施肥方案分析 综合性评价采收期（即150 d时）不同肥料配施下的北苍术生长状况，分析方法采用模糊数学隶属函数法，隶属函数公式如下。当某一指标与生长状况呈负相关时，采用公式（2）进行计算[11]。

U（X）=(X－min)/(max－min) （1）

U（X）=1－(X－min)/(max－min) （2）

U（X）为不同肥料配施下北苍术某个测定指标，min为该指标的最小值，max为该指标的最大值。

通过计算不同肥料配施下北苍术各指标的平均隶属函数值，分析施肥条件对北苍术生长的影响。平均隶属函数值越大，说明该施肥条件越有利于北苍术生长。由表4可知，不同肥料配施下各指标的隶属均值均大于空白组T0，北苍术根茎倍半萜类成分含量的隶属函数从小到大依次为T0＜T5＜T9＜T8＜T1＜T7＜T4＜T2＜T3＜T6。说明不同肥料配施直接影响北苍术根茎倍半萜类成分积累，适宜的氮磷钾配施可以积极作用北苍术生长，基于此分析，T6（N2P3K1）方案效果最优。

3.2 肥料配施对2种生物合成关键酶基因活性和表达量的影响

3.2.1 不同氮、磷、钾配施对北苍术关键酶HMGR活性的影响北苍术种苗基础关键酶HMGR活性为（63.38±1.19）U/L。由图6可知，不同肥料配施下，北苍术关键酶HMGR活性在移栽30～90 d呈下降趋势，90～120 d无显著变化，移栽150 d较120 d整体呈上升趋势。移栽150 d时关键酶HMGR的活性范围在64.530 0～96.388 0 U/L，达到了相较于整个时期的较高水平。T4施肥方案在移栽30～150 d关键酶HMGR活性较高，特别是移栽60～150 d，关键酶HMGR活性分别是84.857 9、83.273 2、81.579 2、81.415 3 U/L，是空白组T0的1.15、1.29、1.44、1.17倍。纵观整个生长期，T4施肥方案下，发育期内HMGR活性相较于其他方案表现为更高水平，推测此方案影响倍半萜类成分的生物合成，说明合理的施肥方案可以提高酶活性，促进北苍术次生代谢。

表4 不同氮磷钾配方施肥下北苍术根茎倍半萜类成分含量的隶属函数分析

Table 4 Membership function analysis of content of sesquiterpenes in rhizomes of A. chinensis under different NPK fertilization

编号质量分数/%隶属均值 苍术酮白术内酯II β-桉叶醇 T000.0300.01 T10.680.320.070.36 T20.761.000.420.73 T30.990.640.690.77 T40.860.100.540.50 T50.340.060.050.15 T61.000.441.000.81 T70.210.600.620.48 T80.4000.540.31 T90.520.070.180.26

图6 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶HMGR活性的影响()

3.2.2 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶FPPS活性的影响 北苍术种苗基础关键酶FPPS活性为（326.67±8.90）U/mL。根据图7可知，不同肥料配施下，移栽30～90 d后关键酶FPPS活性呈现下降趋势，移栽30d的关键酶FPPS活性差异最显著，活性范围426.111 1～582.777 8 U/mL。移栽120～150 d，各方案下的北苍术根茎中FPPS活性与90 d相比整体呈上升趋势。其中T6方案在所有施肥方案中FPPS活性水平相对较高，特别在60～150 d阶段，分别为553.333 3、423.958 3、577.916 7、531.388 9 U/mL，是空白组的1.06、1.52、1.16、2.56、1.14倍。由上可知，T6施肥方案下北苍术根茎中关键酶FPPS活性较高，结合对HMGR活性的分析，可以发现不同酶对倍半萜类成分合成的促进作用可能不同，合理的肥料配施对北苍术生长发育有促进作用。

3.2.3 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶基因表达量的影响 基因相对表达量以种苗基础表达量为单位进行计算（下同）。由图8可知，不同肥料配施下，北苍术根茎中关键酶基因相对表达量在移栽30～120 d呈现下降趋势。移栽150 d时，各处理组关键酶基因相对表达量较前阶段整体呈上升趋势，范围在2.568 7～11.463 7。

T4施肥方案在移栽30～150 d各个时期关键酶HMGR相对表达量处于较高水平，特别是在移栽60～150 d这个时期，T4施肥方案下关键酶基因相对分别是11.9921、9.254 3、6.465 0、7.544 44，是空白组的2.93、2.70、3.43、1.35倍。综上分析可知，北苍术根茎中关键酶基因相对表达量与活性存在同样的变化趋势，即在T4施肥方案下，关键酶基因表达量发育期内表达最高，进一步说明此方案积极影响倍半萜类成分生物合成。

图7 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶FPPS活性的影响()

图8 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶基因HMGR表达量的影响()

3.2.4 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶基因表达量的影响 由图9可知，从整体上看，移栽30～150 d的北苍术在不同肥料配比处理下，各方案根茎中关键酶基因相对表达量呈现先下降后升高的趋势，且移栽90 d时，各方案下的关键酶基因相对表达量较低，范围为1.570 3～3.971 6。不同方案在移栽120 d和150 d时关键酶基因FPPS相对表达量整体呈上升趋势，T3、T4、T5、T6、T7试验组的关键酶基因相对表达量在移栽150 d时较前一时期增加，范围在6.789 2～12.705 5。由此分析，不同施肥方案下的北苍术根茎中关键酶基因表达量变化程度不同，但变化趋势与其活性的整体变化趋势相似，证明了关键酶基因的表达可以调控酶活性，以便深入研究北苍术倍半萜类成分的生物合成。

3.3 肥料配施对北苍术3种倍半萜类成分及2种生物合成关键酶基因表达相关性分析

根据北苍术生长发育期苍术酮、白术内酯II、β-桉叶醇含量，关键酶HMGR、关键酶FPPS活性及关键酶基因、相对表达量变化，对北苍术3种倍半萜类成分含量和2种生物合成关键酶活性及基因表达量进行相关性分析，结果见表5。

相关性分析结果（表5）表明，倍半萜类成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇之间相关程度不同，其中白术内酯II与β-桉叶醇的相关性（相关系数0.564），较白术内酯II与苍术酮的相关性（相关系数0.291）更显著。关键酶HMGR和FPPS活性及相对表达量之间无显著相关关系，说明了和基因相互独立表达。和基因和相对应的酶之间则均表现出极显著正相关（＜0.01），其中关键酶FPPS活性与对应基因相对表达量相关系数略低（相关系数0.495）。根据3种倍半萜类成分与2种关键酶及基因的相关性可知，苍术酮与关键酶和的基因表达量均呈显著相关（＜0.05），说明北苍术根茎中苍术酮的合成同时受到这2种基因的影响。白术内酯II与2种关键酶HMGR和FPPS活性均呈极显著正相关（＜0.01），与关键酶HMGR活性相关性（相关系数0.395）略小于与FPPS活性相关性（相关系数0.500）；白术内酯II与关键酶基因FPPS正相关关系较强（＜0.05），说明白术内酯II的生物合成与关键酶FPPS有关。β-桉叶醇与2种关键酶及其基因相关程度不同，与关键酶FPPS活性及基因表达量的相关性（＜0.01），较与关键酶HMGR活性与基因表达量的相关性更显著（＜0.05），说明关键酶FPPS较HMGR在β-桉叶醇的生物合成中作用更明显。综上可知，北苍术根茎中倍半萜类成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇的生物合成受到多种基因及酶的调控，其中关键酶FPPS调控作用较强。

图9 不同氮磷钾配施对北苍术关键酶基因FPPS表达量的影响()

表5 不同氮磷钾配施下北苍术倍半萜类成分与关键酶活性及基因表达量相关性分析

Table 5 Correlation analysis of sesquiterpene components with key enzyme activities and gene expression in A. chinensisunder different combined applications of nitrogen, phosphorus and potassium

指标相关系数 苍术酮白术内酯IIβ-桉叶醇HMGRFPPSHMGR/EF-1αFPPS/EF-1α 苍术酮1.000 0 白术内酯II0.291 0*1.000 β-桉叶醇0.041 70.564**1.000 HMGR0.198 00.395**0.306*1.000 0 FPPS−0.059 70.500**0.659**0.162 01.000 HMGR/EF-1α0.290 0*0.2220.330*0.624 0**0.1311.000 FPPS/EF-1α0.279 0*0.382**0.452**0.067 90.495**0.2191.000

*＜0.05**＜0.01

4 讨论

肥效管理是中药材田间科学管理的关键要素之一，环境对于药用植物的药效物质也起到一定的决定作用，科学合理的施肥能有效增加药材产量和改善药材品质[14-15]。逯莉等[16]研究发现，用微生物肥和农家肥等量配比进行施肥，可以获得优质高产的黄精。药用植物的栽培种植不仅要保证经济产量，更应重视药材内在质量。研究表明[11]不同氮、磷、钾配方施肥下北苍术根茎中苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇的含量均有显著性增加，而且各有效成分的变化与产量变化均呈正相关，与氮、磷、钾的用量变化存在交互效应，说明合理的氮、磷、钾配方施肥可以保证北苍术高产优质。本研究发现，不同氮、磷、钾配施下北苍术在生长发育过程中，关键酶HMGR和FPPS活性及基因表达量差异显著，说明合理施肥对促进北苍术的次生代谢具有重要作用，对北苍术的药材品质有影响。Wang等[17]对药用植物黄花蒿的研究中发现基因和基因单个过表达及同时过表达对倍半萜类成分青蒿素含量的提高均有显著作用。丁逸雪等[18]对白术倍半萜成分的研究中发现高经度、低纬度、高海拔的环境有利于白术倍半萜成分的积累，说明药用植物生长发育具体情况及环境条件的变化对次生代谢产物积累具有重要作用，对倍半萜的积累量影响显著。另外，关键酶FPPS及其基因与苍术酮、白术内酯II、β-桉叶醇含量的正相关关系，以及在一定的肥料配施下，关键酶HMGR和FPPS活性及其基因表达量显著提高，进一步说明其在倍半萜类成分合成途径上具有重要的调控作用，合理施肥对促进北苍术的次生代谢具有重要作用。董天旺[19]研究发现，生物有机肥和氮、磷肥合理配施显著促进了太白贝母的生长和生物碱的积累量，说明了科学合理的肥料配施是药材品质的保障。肖婉君等[20]研究发现，肥料施用对当归药材有显著的增效作用，可以改善药材性状，提高当归的产量和质量。袁勇等[21]也做过相关探讨，指出科学施肥，补充营养元素，是提高中药材质量的重要措施，氮、磷、钾的合理施用可以促进营养成分、有效成分的合成与积累。

综上所述，本研究发现北苍术根茎中倍半萜类成分苍术酮、白术内酯II和β-桉叶醇的生物合成受到多种基因及酶的调控，其中关键酶FPPS发挥了较大的调控作用。科学合理的肥料配施可促进北苍术倍半萜类成分含量的增加，并显著提高其生物合成关键酶HMGR和FPPS的活性及基因表达。因此，在北苍术的栽培种植过程中，合理的肥料配施可以提高北苍术倍半萜成分的积累，保障其质量。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effects of combined application of fertilizer on gene expression of three sesquiterpenes and two key biosynthesis enzymes in

WANG Meng-cong, WENG Li-li, SUN Jin, XIAO Chun-ping, CHEN Tian-li

College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117 , China

To investigate the effects of different fertilizer combinations on the contents of sesquiterpene components in, including atractylone, atractylenolide-II and β-eudesmol, and the activities and gene expression of the key enzymes for biosynthesis of 3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase (HMGR) and farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS).Under different fertilizer combinations, the contents of three sesquiterpenes inwere determined by HPLC, and the activities of HMGR and FPPS in rhizomes ofwere determined by kit method (double antibody sandwich method). qRT-PCR was used to determine the expression levels of HMGR and FPPS in. SPSS software was used to analyze the correlation between the activities of key enzymes in biosynthesis and gene expression quantity.The suitable combination of nitrogen, phosphorus and potassium could promote the accumulation of sesquiterpenes in, and significantly improved the activity and gene expression of key enzymes in biosynthesis. The optimal fertilization scheme for sesquiterpene accumulation under the soil fertility condition represented by the test area was N 180 kg/hm2, P2O5225 kg/hm2and K2O 105 kg/hm2. Under different fertilizer combinations, the key enzyme gene HMGR was significantly positively correlated with atractylone and β-eudesmol (< 0.05). The key enzyme gene FPPS was significantly positively correlated with atractylenolide II and β-eudesmol (< 0.01), and significantly correlated with atractylone (< 0.05).The optimization of nitrogen, phosphorus and potassium fertilizer application has an effect on the accumulation of atractylone, atractylenolide II and β-eudesmol in, and also has significant effects on the activities and gene expression of key biosynthesis enzymes of HMGR and FPPS. The biosynthesis of sesquiterpenes atractylone, atractylenolide II and β-eudesmol in rhizomes ofis regulated by a variety of genes and enzymes, and the key enzyme FPPS plays a greater regulatory role.

(DC.) Koidz.; combined application of fertilizer; sesquiterpene; 3-hydroxy-3- ethylglutarate monoacylase A reductase; farnesyl pyrophosphate synthase; gene expression; atractylenolone II; β-eudesmol; atractylenone

R286.2

A

0253 - 2670(2022)13 - 4109 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.024

2021-11-06

国家自然科学基金资助项目（81803649）；吉林省科技厅科技项目（20191102035YY）；吉林省中医药管理局科技项目（2020047）

王孟聪，硕士研究生，研究方向为中药品质鉴定、质量标准以及开发利用。Tel: (0431)81672193 E-mail: 15630714647@163.com

肖春萍，讲师，博士，研究方向为中药资源、栽培理论和资源开发。Tel: (0431)81672193 E-mail: btxnw@163.com

陈天丽，实验师，博士，研究方向为中药药剂学与药效物质基础研究。Tel: 18604437775 E-mail: 731116920@qq.com

[责任编辑 时圣明]