芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠TRPA1、P物质的影响

王 磊，蒙艳丽，王 博，王晓溪，王 欣，梁明川，王伟明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150000)

肺炎支原体引发的咳嗽可持续数月，刺激气道上皮产生慢性炎症[1]，此时咳嗽蛋白TRPA1被激活，释放气道神经源性炎症介质P物质[2]。现阶段治疗主要以大环内酯类抗生素类为主，但是大环内酯类抗生素以治疗肺炎支原体感染为主，因此通常需要联合止咳药治疗。并且研究发现中国和日本过度使用大环内酯类抗生素，85%以上的肺炎支原体肺炎儿科病例对大环内酯类抗生素具有耐药性[3]。

芩百清肺浓缩丸由黄芩、百部等6味中药组成，具有清热解毒、润肺止咳之功效[4-5]。前期实验表明，芩百清肺浓缩丸可减少肺炎支原体感染的人肺癌细胞A549的增殖[6]，抑制肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎小鼠纤维素沉积[7]，并且还可以抑制支原体黏附蛋白P1和P30表达[8]。本研究观察了芩百清肺丸对支原体感染小鼠的止咳作用，应用免疫组化和RT-PCR实验观察芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠咳嗽蛋白TRPA1、P物质因子的影响。报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 40只SPF级6周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，体质量20～22 g,购买于哈尔滨医科大学实验动物学部，动物合格证号：SCXK(黑)2019-001，饲养于GLP实验室。严格按照《黑龙江省实验动物护理和使用指南》的建议进行本研究。该方案经黑龙江省中医科学院动物护理和使用委员会批准(许可编号：[2011]93号)。

1.2 实验药品及试剂 芩百清肺浓缩丸：哈尔滨天合力制药有限公司，批号：200101，用生理盐水配成0.11 g/mL溶液；阿奇霉素分散片：石药集团欧意药业有限公司，批号：274180404，用生理盐水配成1.5 g/L溶液。一抗TRPA1：Proteintech公司；P物质：美国Abcam公司；兔超敏免疫组化试剂盒：北京中山金桥公司；RT-PCR 试剂盒：Promega 公司。

1.3 实验仪器 恒温培养箱：北京市六一仪器厂公司；BX41-DP72 生物显微镜：Olympus；超纯水制备仪：广州吉迪仪器有限公司；ST-16R型低温高速离心机：美国Thermo Fisher Scientific公司；BP211D 型电子天平：Sartorius 公司；DP73显微镜成像系统：Olympus；多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；Line Gene 9600 Real-Time PCR仪：中国博日公司。

2 实验方法

2.1 肺炎支原体的培养 肺炎支原体：American Type Culture Collection，批号：ATCC15531，于含20%胎牛血清PPLO培养基培养，每隔7 d传代1次，感染小鼠造模的菌种选用传代的第3 代。

2.2 动物分组、造模和给药 小鼠饲养3～5 d适应环境后，将40只小鼠随机分成4组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性对照组和芩百清肺浓缩丸组(芩百组)。除正常组外，其余各组小鼠鼻腔滴入20 μL106CCU肺炎支原体培养液造模，连续3 d。阳对组予阿奇霉素(0.03 g/kg)灌胃，芩百组予芩百清肺浓缩丸(2.34 g/kg)灌胃，每日1 次，正常组、模型组予等体积生理盐水，连续灌胃7 d。

2.3 观察指标

2.3.1 引咳实验 给药7 d后，将各组小鼠置于倒置的500 mL烧杯内，吸取0.5 mL氨水，滴加在棉球上，迅速扣严烧杯，观察和记录小鼠3 min内咳嗽次数。

2.3.2 肺组织病理学变化 引咳实验结束后脱颈椎处死小鼠，取左肺，置于10%福尔马林24 h，石蜡包埋切片，于65 ℃烘箱烘烤1 h，依次用二甲苯脱蜡3次，每次10 min，无水乙醇3次，每次2 min，95%乙醇Ⅰ 2～3 min，95%乙醇Ⅱ 2～3 min，90%乙醇Ⅱ 2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，再放入蒸馏水5 min，苏木素染色液3～5 min，自来水冲洗5 min，置于1%盐酸乙醇30 s，自来水冲洗5 min，置于伊红染色液3～5 min，酒精梯度脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。

2.3.3 免疫组化法检测TRPA1蛋白表达 将小鼠肺组织石蜡切片于65 ℃烘箱烘1 h后，经过脱蜡后，放置于煮沸的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，煮沸10 min，置冷水冷却后，将配制好的PBS缓冲液清洗3次，H2O2去离子水孵育10 min，PBS缓冲液冲洗3次，滴加一抗(TRPA1 1∶300)孵育,置于4 ℃冰箱过夜。第2天，根据免疫组化试剂盒说明书，滴加反应增强液孵育，再用PBS缓冲液冲洗3 次，滴加二抗，孵育1 h，采用DAB显色8 min后，复染，封片。根据IHC评分标准进行评分统计，IHC评分标准：每张切片选取3个视野，从着色深浅程度及其面积进行评分。着色深浅程度：浅色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；着色细胞面积：在25%以下计1分，在25%～49%计2分，在50%以上计3分。以二者乘积为综合得分统计。

2.3.4 RT-PCR法检测肺组织TRPA1mRNA和P物质表达 取小鼠右肺组织50 mg置于研磨管中，加入1 mL Trizol溶液和2个钢珠，低温匀浆120 s，室温静置30 min，直至溶液变澄清。加入0.2 mL氯仿，振荡15 s并静置5 min，置于4 ℃离心机中以12 000 r/min的转速离心15 min，使用移液枪吸出上清液转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀管中液体，室温静置10 min后离心取上清，加入75%乙醇后离心舍弃上清，室温静置干燥15 min，加入20 μLDEPC水，置于65 ℃水浴锅中促溶10～15 min。使用酶标仪测定各组mRNA浓度， 根据mRNA浓度测定结果，用无核酸水稀释为100 mg/L，将PCR反应体系加样至8连排中，PCR反应体系的配制为：Go Taq qPCR Master Mix，2X：10 μL；Supplement MgCl2，25 mmol/L：1.5 μL；GoScript RT Mix for 1-step RT-Qpcr，50X：0.4 μL；Supplement CXR Reference Dye，30 mmol/L：0.4 μL；Nuclease-Free water：4.7 μL；Forward Primer，10X：1 μL；Reverse Primer，10X：1 μL；RNA Template：1 μL，以200 r/min转速离心1 min，使其充分混匀，取出后放置于PCR扩增仪中循环扩增。

反应扩增条件为：37 ℃(900 s)，循环1次；95 ℃(600 s)，循环1次；95 ℃(10 s)，循环40次；60 ℃(30 s)，循环40次；72 ℃(30 s)，循环40次。溶解曲线：起始温度为72 ℃.恒温10 s；采样模式：单次，台阶温度：0.5 ℃。反应结束后查看荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，输出Ct值，计算2-ΔΔCt值，以模型组为参比，设定表达量为1，计算其余组相对模型组数值，进行比较。

引物基因序列如下：TRPA1正向5’-GOGGTTGGGGACATTGCTGAG-3’，TRPA1反向5’-TGGATACACGATGGTGGACCTCTG-3’；P物质正向5’-TTGGTCCGACTGGTCCGACAG-3’，P物质反向5’-GAACTGCTGAGGCTTGGGTCTTC-3’；β-actin正向5’-GACGGCCAGGTCATCACTAT-3’，β-actin反向5’-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3’。

3 结果

3.1 各组小鼠引咳实验结果 见表1。

表1 各组小鼠氨水引咳实验结果次/3 min)

3.2 各组小鼠肺组织HE染色结果 正常组小鼠肺组织结构完整，无感染现象。模型组小鼠肺组织可见大量炎细胞浸润，肺组织结构不完整，支气管黏膜水肿，间隙变窄。与模型组相比，芩百组和阳对组病变不同程度地减轻，芩百组支气管水肿减轻，有少量炎细胞浸润。见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化(HE，×40)

3.3 各组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达免疫组化检测结果 见图2，表2。

图2 各组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达的免疫组化检测结果(×40)

表2 各组小鼠肺组织TRPA1免疫组化IHC评分结果分)

3.4 各组小鼠肺组织TRPA1mRNA和P物质mRNA表达的 RT-PCR检测结果 见表3。

表3 各组小鼠肺组织TRPA1、P物质 mRNA表达的比较

4 讨论

肺炎支原体主要通过空气飞沫传播进入人体呼吸道，使呼吸道黏膜上皮细胞受到破坏，上皮细胞纤毛活动变慢，甚至完全脱落，同时支气管壁肥厚，管腔变小，痰不易排出，进而引起剧烈咳嗽[9]。咳嗽是指迷走神经传入离子通道并被激活的一种反射，这些离子通道其中包括阳离子选择性通道的瞬时受体电位(TRP)家族[10]。TRP家族作为气道感觉神经元上咳嗽感受器，在咳嗽发病中发挥重要作用。TRPA1是一种电位依赖的Ca2+可渗透阳离子通道，其氨基端有14个蛋白重复，属于TRP家族较大的分支之一。主要激活模式是通过对N-末端半胱氨酸或赖氨酸的共价修饰，当TRPA1被激活活化后，释放更多的神经肽和气道神经源性炎症介质P物质，从而诱发咳嗽[11-12]。在临床试验和豚鼠模型中，TRPA1已被确认为促咳受体，可以选择此受体作为拮抗阻断剂[13-14]，为潜在的镇咳药物的研究开辟了一个全新的领域。

芩百清肺浓缩丸是以经方止嗽散为基础方，在临床研究基础上经加减而成的治疗肺炎支原体肺炎的有效方剂，本实验观察了芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠咳嗽蛋白TRPA1及气道神经源性炎症介质P物质的影响。结果可见芩百组能够减少咳嗽次数，改善小鼠肺组织病理变化，降低咳嗽蛋白TRPA1蛋白表达，下调咳嗽蛋白TRPA1及气道神经源性炎症介质P物质mRNA表达。表明芩百清肺浓缩丸可有效缓解支原体肺炎的咳嗽症状，减少咳嗽因子TRPA1及气道神经源性炎症介质P物质的表达是其部分作用机制。