艾灸对慢性疲劳综合征大鼠肠黏膜屏障修复及疲劳改善作用的研究

李超然，王 雪，冯楚文，杨 燕，孙忠人，王玉琳，屈媛媛，王庆勇，孙维伯，杨添淞

(1浙江中医药大学·浙江 杭州 310000；2黑龙江中医药大学·黑龙江 哈尔滨 150040；3重庆市长寿区人民医院·重庆 4012202；4哈尔滨医科大学·黑龙江 哈尔滨 150086)

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一种以长期(超过6个月)且严重的疲劳为主症的神经系统疾病，伴随有胃肠道症状(腹痛、腹泻和/或便秘)[1]。研究指出CFS的发生可能继发于胃肠道感染，事实上，CFS与肠易激综合征或者克罗恩病常合并出现[2]。CFS患者肠道菌群失调，可能伴随有肠道炎症反应，肠黏膜屏障功能受损，导致肠道“易怒”[3-4]；通过作用于肠道的感觉、运动和免疫系统，影响中枢神经系统，引发本病[4]。紧密连接蛋白包括闭合蛋白(Occludin)和闭锁连接蛋白(Zonula occludens，ZOs)等，是保护肠黏膜完整性的首要物理屏障[5]。当紧密连接蛋白表达下降时，会破坏肠道屏障的完整性，使肠道通透性加大，内毒素移位，激活机体的免疫炎症反应。

本病在中医属“虚劳”范畴。多项临床研究表明，艾灸疗法可有效改善疲劳与精神状态，缓解胃肠道症状，提高患者生存质量[6]。虽然艾灸治疗CFS的疗效确切，但关于其机制的探索尚未完全明晰，研究多集中于中枢神经系统，而从外周系统，尤其是肠道角度，探究其作用机制的研究仍然较少。本实验通过观察艾灸干预后CFS模型大鼠的一般情况、结肠组织病理学以及对结肠紧密连接蛋白表达的变化，探究艾灸抗慢性疲劳的机制，为今后CFS的临床诊疗与应用推广提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体质量180～220 g，鼠龄5～6周。大鼠自由饮食水，饲养在温度20～23℃、湿度40%～70%的环境中。实验大鼠由青岛市实验动物和动物实验中心提供。实验动物许可证编号SCXK(鲁)2014-0001。实验过程符合黑龙江中医药大学动物实验室使用及伦理标准(批准号：2018062001)。

在大鼠适应性饲养的第4～7 天进行适应性跑步，训练速度为10 m/min、15 m/min、20 m/min，每天30 min。通过筛选，剔除不会跑步与排便异常的大鼠。

1.2 主要试剂与仪器 总RNA提取试剂：北京天根生化科技公司；引物：苏州金唯智生物科技有限公司；Occludin兔源多克隆抗体、ZO-1兔源多克隆抗体、山羊抗兔IgG-HRP抗体：北京博奥森公司；伊红染液、苏木素染液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。大鼠实验用细艾条(7 mm×12 mm)：南阳汉医艾绒有限责任公司。大鼠跑步机：北京众实迪创科技发展有限责任公司；LED灯：nVc/雷士LED灯；音箱：HYUNDAI/现代音箱；病理切片机：上海徕卡仪器有限公司；显微镜：日本，OLYMPUS；酶标仪：美国，SpectraMax；电子天平：德国，利多斯；电泳仪、转膜仪：美国，伯乐；Real-Time PCR 仪：美国，ABI；台式高速大容量离心机：德国，Eppendorf；红外线测温仪：深圳市莱讯特科技有限公司。

1.3 造模方法 制备模型方法为多因素诱导的复合应激方法[7]。应激方式包括跑台训练+束缚应激+睡眠干扰+拥挤处理4种，造模时长35 d。①跑台训练：每日7:00开始，以小组(每6只大鼠)为单位进行跑步1 h，速度20 m/min；②束缚应激：跑步1 h后，将造模大鼠置于自制束缚桶中2 h；③睡眠干扰：包括强光和噪音刺激。每日19：00～7：00，将大鼠置于充足日光灯照射和循环播放摇滚音乐(70～80 dB)的房间中；④拥挤处理：保证大鼠每日拥挤21 h。拥挤方式是将每3只大鼠放置于一个小饲养笼(25 cm×14 cm×14cm)中，共同摄食和饮水。

1.4 动物分组与干预处理 按照随机数字表法，将大鼠分为正常组12 只和造模组36 只。CFS建模成功的大鼠随机分为3组，模型组、艾灸A组和艾灸B组，每组12只。继续造模并艾灸35 d。①正常组：正常饲养；②模型组：仅捆绑不干预；③艾灸A组：温和灸神阙(脐中央)、关元穴(脐下25 mm)，距穴位2.5 cm施灸；④艾灸B组：温和灸双侧足三里穴(腓骨小头下5 mm)，距穴位2.0 cm施灸。腧穴定位依据《实验针灸学》[8]。每次灸10 min，每日1次。使用红外线测温仪记录穴位皮肤温度，保证温度在41～45 ℃。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 一般情况评价 在整个实验过程中，对大鼠的精神状态、体质量、摄食摄水量、活动情况、皮毛色泽、耳尾颜色和粪便形态进行实时评估和记录。

1.5.2 结肠组织病理学观察 取大鼠结肠组织，经乙醇溶液逐级脱水、二甲苯透明后浸蜡包埋，制成3 μm病理组织切片。常规脱蜡后进行HE染色，脱水封片。于光镜下观察各组大鼠结肠组织形态。

1.5.3 结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达检测 采用Western blot法。取大鼠结肠组织，研磨成匀浆后裂解，上清提取总蛋白，用BCA法定量蛋白浓度。取50 μg样本加入适量5×蛋白上样缓冲液，使样本变性，并进行SDS-PAGE电泳分离。于250 mA恒流和PVDF膜条件下转膜1.5 h；依次加入一抗(ZO-1浓度 1∶500；Occludin浓度 1∶500)、二抗(羊抗兔IgG-HRP浓度 1∶3 000)，进行封闭和抗体孵育。沥干PVDF膜，进行ECL显色。最后放入全自动化学发光图像分析系统成像，使用Gelpro32对条带进行灰度值分析。

1.5.4 结肠组织ZO-1和Occludin mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取大鼠结肠组织，使用Trizol提取总RNA。检测RNA浓度，进行DNA体外反转录，引物序列见表1。最后进行RT-PCR程序扩增。用2-ΔΔCt计算正常对照组、模型组和艾灸A、B组大鼠ZO-1、Occludin基因的相对表达情况。

表1 ZO-1和Occludin mRNA引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模后，大鼠体质量明显降低，摄食水量减少，出现毛发枯槁、精神倦怠、活动减少、耳尾颜色苍白、便质稀软等表现。艾灸组大鼠的体质量、摄食和摄水情况改善不明显，精神状态较活跃，皮毛光泽度恢复，耳尾和爪甲颜色转红，便质成形。

2.2 各组大鼠结肠组织病理学观察结果 见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理学观察(HE，×100)

正常组大鼠结肠黏膜光滑，组织结构基本完整，黏膜细胞间紧密连接，无水肿及炎性浸润。CFS模型大鼠可见结肠组织整体结构异常，黏膜层充血水肿，伴有少量炎症细胞浸润(黑色箭头)；杯状细胞数量减少且受损萎缩，排列疏松紊乱(黑色渐变箭头)；黏膜下层及肌层可见大量炎症细胞浸润(白色箭头)。艾灸组大鼠结肠组织上述结构的病理改变明显减轻，黏膜层正常，黏膜上皮未见断裂脱落；杯状细胞的数量较模型组明显增多(黑色渐变箭头)，形态充盈且排列致密，但在肌间仍可见血管扩张充血(白色渐变箭头)，以及少量炎症细胞浸润改变(白色箭头)。艾灸A组仅肌间可见少量炎症细胞，而艾灸B组黏膜层及肌间均有少量炎症细胞。

2.3 各组大鼠结肠组织紧密连接ZO-1和Occludin蛋白表达检测结果 见图2～图3。

由图2～图3可见，与正常组相比，CFS模型大鼠的结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组相比，艾灸A、B组大鼠的ZO-1和Occludin水平均明显升高(P<0.01)，呈现艾灸A组>艾灸B组>模型组的趋势。此外，在结肠Occludin蛋白的表达上，可见艾灸A组在统计学上是高于艾灸B组的，具有明显差异(P<0.01)，而两组在ZO-1蛋白表达上则未见明显差异(P>0.05)。

注：两组间比较，*P<0.05，*P<0.01(动物数：12 只)

注：两组间比较，*P<0.05，*P<0.01(动物数：12 只)

2.4 各组大鼠结肠组织紧密连接ZO-1、Occludin mRNA表达检测结果 见图4～图5。

由图4～图5可见，模型组大鼠结肠组织ZO-1和Occludin基因的相对表达明显低于正常组(P<0.01)。艾灸组大鼠结肠组织ZO-1和Occludin的基因表达量显著升高(P<0.01)。两艾灸组分别与正常组比较，均无统计学意义(P>0.05)。同时，艾灸A、B组的组间比较也无差异(P>0.05)。

注：两组间比较，*P<0.05，*P<0.01(动物数：12 只)

注：两组间比较，*P<0.05，*P<0.01(动物数：12 只)

3 讨论

近年来，CFS的患病率日益增高。流行病学调查显示全球的发病率高达0.4%～2.5%[9]，影响近0.9%人口的健康[10-11]，已成为一个严重的公共卫生问题。研究发现CFS患者常伴有消化系统的功能紊乱，伴有肠易激综合征的患者，出现疲劳的情况更加严重[12]。由于CFS的临床表现多样，且病因病机不明确，目前仍缺乏有效的治疗方法[1]。口服益生菌能在一定程度上改善胃肠道功能和疲劳状态，但仅为对症治疗，且远期疗效欠佳[13]。

在中医领域，CFS可归属为“虚劳”“虚损”的范畴。其病机多责之脏腑功能失调和气血运行失常。艾灸能助气血运行以充养脏腑，培元固本以补周身阳气。《灵枢·邪气脏腑并形篇》中提到“阴阳皆虚，火自当之”。久虚之人必阳气衰微，艾灸可振奋元阳，强壮身体。此外，艾灸还可温通经络，调理胃肠。《灵枢·经脉》中云：“灸则强食生肉”，身强体健则疲劳感自除。本实验选取的神阙、关元和足三里穴皆为人体保健抗疲劳的要穴，是国医大师孙申田教授的多年临证经验。神阙和关元穴内系十二经脉，五脏六腑，外达四肢百骸，是人体真元之所在，具有平衡阴阳和沟通内外的作用；两穴均位于腹部，艾灸两穴不仅能够抗疲劳，还能将温热之力直达胃肠，调节胃肠道功能。足三里穴为胃经的下合穴，足阳明胃经多气多血，艾灸此穴能通调脾胃，濡养肌肉，补后天之本以改善疲劳。

研究表明CFS患者肠黏膜屏障功能受损[3-4]。作为肠黏膜屏障的第一门户，肠上皮屏障是由肠上皮细胞和邻近细胞间的紧密连接共同构成。导致肠上皮屏障损伤的主要原因是紧密连接功能丧失。Occludin和ZO-1是肠上皮屏障中重要的紧密连接蛋白，对于调节肠上皮细胞旁的渗透性至关重要。其中，Occludin是构成紧密连接的主要成员，主要负责调控大分子的选择通过性，在维持肠道结构稳定性与功能特性方面发挥关键作用[5]。ZO-1是一种紧密连接的特异性蛋白，常用来客观评估肠道物理屏障功能和通透性高低[5]。已有研究指出，Occludin和ZO-1可以作为评价CFS肠道紧密连接屏障完整性的代表性指标[14]。

在本研究结果中，笔者发现CFS模型大鼠结肠黏膜充血水肿，杯状细胞数量减少，而炎症细胞大量分泌，同时伴随ZO-1，Occludin蛋白和基因的表达明显下调；提示慢性疲劳状态下，大鼠结肠组织炎性改变，肠上皮屏障的结构与功能破坏。在分别艾灸神阙、关元穴和双侧足三里穴后，可见结肠组织结构损伤恢复，通过提高Occludin和 ZO-1蛋白和基因的相对表达量，修复CFS模型大鼠受损的紧密连接。通过对大鼠一般情况的观察，笔者认为艾灸能够缓解疲劳，尤其以活跃CFS模型大鼠精神状态与促进便质成形为突出表现；但艾灸干预后，大鼠体质量、摄食和摄水情况仍未见明显改变，考虑是治疗时大鼠依然处在小饲养笼中继续造模，拥挤的环境制约了主观活动，极大影响了体质量和饮食水量的恢复。此外，本研究提示，艾灸两组在对CFS模型大鼠肠道屏障的修复上也存在差异。艾灸神阙、关元穴调节Occludin蛋白表达的能力优于艾灸足三里穴，可能是由于神阙和关元穴毗邻腹部，能够将刺激作用直达胃肠，明显修复肠道紧密连接结构。综上，保护肠道紧密连接的完整性可能是CFS诊疗的靶点之一。艾灸对CFS模型大鼠的治疗作用可能是通过改善结肠黏膜组织形态，促进紧密连接蛋白的表达，修复损伤的肠黏膜屏障，从而抑制炎症反应，间接发挥神经保护作用。