急性心肌梗死患者外周血NO-PGC1α线粒体生物合成通路相关基因的表达及其临床意义*

壮婷，杨帆

（常州市第二人民医院 急诊科，江苏 常州 213000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是心血管疾病死亡的主要原因，多发于老年人，具有发病急、进展快的特点[1-2]。早期有效预测AMI 的发生、尽早开展防治措施对降低AMI 死亡风险意义重大，但目前临床缺乏新型早期有效预测AMI 发生的高效、客观的生化指标。已有报道显示，血清外连素[3]、高敏C 反应蛋白[4]与多数AMI 发生相关，但目前临床预测AMI 仍不理想[5]，迫切需求更多可安全、高效、客观地预测AMI 发生的生化标志物，以便指导早期治疗，改善预后。

AMI 患者冠状动脉供血不足，导致心肌细胞出现不可逆转损伤。近期有研究显示，心肌细胞损伤与过量活性氧有关[6]。一氧化氮-过氧化物酶体增殖物激活受体γ 共激活因子1α（nitric oxideperoxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α, NO-PGClα）线粒体生物合成通路蛋白是线粒体生物发生的重要蛋白质，NO-PGC1α 可通过促进线粒体氧化代谢，生成活性氧[7]。线粒体功能生物合成障碍与多种心血管疾病有关[8-9]。一氧化氮NO 作为维持心血管内环境稳定的重要分子之一，NO 信号通路分子精氨酸酶2（arginase 2,Arg2）、一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase 1,NOS1）可通过竞争底物L-精氨酸调节NO，生成的NO 可能通过调节NOPGC1α 表达调控线粒体生物合成，影响AMI 的发生。目前国内尚未见外周血NO-PGC1α 线粒体生物合成通路相关基因表达与AMI 发生关系的报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年5 月—2021 年6 月常州市第二人民医院收治的AMI 患者103 例为AMI 组。其中男性59 例，女性44 例；年龄45～80 岁，平均（63.84±7.01）岁。另取同期该院健康体检者69 例为对照组,男性36 例，女性33 例；年龄47～80 岁，平均（61.95±6.89）岁。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属自愿签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1纳入标准①AMI 组符合《急性心肌梗死诊断和治疗指南》[10]AMI 诊断标准，对照组经病史、心电图、心肌标志物及冠状动脉造影等证实无心肌梗死病变；②AMI 组发病至入院时间＜12 h。1.2.2 排除标准 ①伴有血管畸形病变、代谢性脑病、中枢神经系统感染、颅内器质性病变；②近期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝药物等；③伴有外周神经疾病、精神性疾病、认知功能障碍者；④肝、肾等重要脏器功能严重障碍；⑤伴有脑卒中史、严重免疫缺陷、传染性疾病、血液系统疾病、恶性肿瘤、胸部外伤史、血液透析史等；⑥妊娠及哺乳期女性；⑦近期出现急性感染；⑦依从性差；⑧无法配合完成本研究者。

1.3 资料收集

收集两组基本资料及AMI 入院治疗前、对照组体检时生化指标，包括性别、年龄、体质量指数（body mass index, BMI）、基础疾病、吸烟史、饮酒史、甘油三酯（Triglycerides, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、总胆红素、血肌酐、尿酸、尿素氮、血乳酸、白细胞计数（white blood cell, WBC）、血小板计数（Platelets,PLT）、纤维蛋白原、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2, LP-PLA2）、心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ）。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA的表达

AMI 组入院治疗前、对照组体检时抽取静脉血液5 mL 贮存于肝素抗凝管中，采用QIACEN RNeasy Mini 试剂盒提取血中总RNA，microRNA Isolation Kit 试剂盒（美国Bio-Rad 公司）分离RNA，Superscript RT Kit 试剂盒（上海远慕生物科技有限公司）逆转录成cDNA，SYBR Green PCR master Mix 试剂盒（大连宝生生物工程公司有限公司）进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR），在PCR 仪上（美国ABI 公司7500 Fast Real-Time PCR System PCR）测定外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA的表达[11]。反应体系20 μL：基因组DNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 缓冲液10 μL、蒸馏水8 μL。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 个循环。以Ct 值为基础，2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。内参选用GAPDH，qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 冠状动脉病变狭窄程度积分

AMI 组患者入院后进行冠状动脉造影，采用Gensini 积分[12]系统评价患者冠状动脉血管病变狭窄程度。Gensini积分≤40分为轻度狭窄，＞40分～＜80分为中度狭窄，≥80 分为重度狭窄。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线；影响因素的分析采用多因素Logistic 回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMI 组不同病情严重程度患者外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相对表达量比较

103 例AMI 患者中，轻度狭窄患者26 例（25.24%），中度狭窄患者59 例（57.28%），重度狭窄患者18 例（17.48%）。

轻、中、重度狭窄组外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=10.156、28.529 和17.580，均P=0.000）。进一步两两比较结果：重度狭窄组外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量高于中、轻度狭窄组（P＜0.05）；中度狭窄组NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量高于轻度狭窄组（P＜0.05）。见表2。

表2 AMI组不同病情严重程度患者外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相对表达量比较 （x±s）

2.2 AMI组与对照组临床资料比较

AMI 组与对照组的性别、年龄、BMI、基础疾病、吸烟史、饮酒史、TG、TC、HDL-C、ALT、AST、总胆红素、血肌酐、尿酸、尿素氮、血乳酸、WBC、PLT、MMP-9 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。AMI 组与对照组的LDL-C、纤维蛋白原、LP-PLA2 及NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），AMI组LDL-C、纤维蛋白原、LP-PLA2 及NO-PGC1α、NOS1、 Arg2 mRNA 相对表达量高于对照组。见表3。

表3 AMI组与对照组临床资料比较

2.3 影响AMI发生的多因素Logistic分析

以AMI 为因变量（否= 0，是= 1），LDL-C、纤维蛋白原、LP-PLA2 及NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量为自变量（上述计量资料自变量赋值为连续变量），进行多因素Logistic 回归分析。结果显示：NO-PGC1α mRNA [O^R=3.873（95% CI：1.594，9.412）]、NOS1 mRNA [O^R=4.267（95% CI：1.756，10.371）]、Arg2 mRNA [O^R=4.518（95% CI：1.859，10.979）]是影响AMI 发生的独立因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响AMI发生的多因素Logistic回归分析参数

2.4 外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 预测AMI发生的价值

ROC 曲线结果显示，外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 及3 者联合预测AMI 发生的敏感性分别为70.87%、71.84%、75.73%和70.87%，特异性分别为73.91%、72.46%、71.01%和91.30%，曲线下面积（area under curve, AUC）分别为0.764、0.742、0.759和0.908。见表5 和图1。

图1 外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相对表达量预测AMI发生的ROC曲线

表5 外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相对表达量预测AMI发生的效能分析参数

3 讨论

AMI 是临床常见心血管疾病之一，患者发病急，病死率高[13]。临床早期预测AMI、尽早采取防治措施，有助于降低AMI 死亡风险。近期有研究结果显示，线粒体功能生物合成障碍与多种心血管疾病有关，细胞外多种信号通路可影响线粒体生物合成，其中NO-PGC1α 是重要的调节因子之一，NO 可促使线粒体的生物合成[8-9]。NOS 作为调控L-精氨酸/NO 信号通路的重要限速酶，影响细胞内氧化应激状态、心肌细胞内游离Ca2+浓度等，在血管扩张、心肌收缩抑制等生理过程中发挥重要作用[14]。

本研究中多因素Logistic 回归分析结果显示，外周血NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量是影响AMI 发生的独立因素，提示外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量与AMI 发生有关。Arg2 主要存在于心肌线粒体中，通过L-精氨酸底物影响NOS1 活性，调控NO 生成量，影响心血管组织生物学作用。SAVELIEVA 等[15]研究结果显示，升高的Arg2 可能通过NO 信号通路影响心肌肥厚、缺血再灌注损伤等心血管疾病病理过程。Arg2 mRNA 相对表达量升高，使底物L-精氨酸利用率增大，NO 生成量降低，造成机体心肌细胞线粒体生物合成障碍，增大AMI 发生风险。NOS1 属于含铁生物酶之一，是合成NO 的关键酶，NOS1 mRNA 相对表达量升高可促进L-精氨酸产生大量NO，适量NO 具有保护心血管健康的生理功能，过量NO 则损伤心血管系统。PGC1α 主要存在于心肌等耗氧量大、能量需求量高的组织器官中，是心肌细胞线粒体生物合成的重要辅助激活因子、调控因子，可通过调控核呼吸因子、线粒体转录因子A 介导线粒体生物合成，NO-PGC1α mRNA 相对表达量升高可能导致心肌细胞线粒体生物合成功能异常，影响AMI 发生。聂俊刚等[16]研究结果显示，PGC1α可通过氧化应激参与心肌缺血再灌注损伤过程。Arg2 mRNA 相对表达量升高可抑制NO 生成，而NOS1 mRNA 相对表达量升高可促进NO 生成，是相互矛盾的结果，但是NO-PGC1α mRNA 相对表达量升高可从侧面反映NO 含量增加。ROC 曲线结果显示，NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 3 者联合预测AMI发生的特异性、AUC 最大，提示3 者联合预测AMI 发生效能良好，可作为预测AMI 发生的客观生物标志物。此外，本研究还发现重度狭窄组外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 相对表达量高于中、轻度狭窄组，中度狭窄组NO-PGC1α、NOS1、Arg2 mRNA相对表达量高于轻度狭窄组，提示外周血NOPGC1α、NOS1、Arg2 mRNA 不仅与AMI 发生有关，而且与AMI 患者病情也有关，这是笔者后期研究的重点。

综上所述，外周血NO-PGC1α 线粒体生物合成通路的相关基因NO-PGClα、Arg2 、NOS1 mRNA 与AMI 发生有关，3 者联合预测AMI 发生效能良好，且NO-PGClα、Arg2 、NOS1 mRNA 表达可能与AMI患者病情有关，更精准的作用机制有待后续进一步研究阐明。