CTGF对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白表达的调控

王春梅 ，贾聚晨，王保胜，门晶晶，汤晓娜，阴雨奇，赵 锋*

（1.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

乳腺泌乳分化受多种内分泌激素调节，乳腺上皮细胞与细胞外基质相互作用及局部来源生长因子作用是此过程关键因素。结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）是CCN基质细胞蛋白家族成员，具有促进细胞粘附、增殖和分化，参与细胞外基质产生、血管生成、结构重塑等作用。近年来对CTGF的研究多局限于各种疾病，尤其在组织纤维化等病理生理学特征性疾病[1-2]。CTGF 包含4 个高度保守结构域[3-4]，结构域具有调节其他生长因子信号传导并促进组织纤维化作用。Morrison 等在小鼠研究中发现，CTGF 通过调节细胞外基质细胞粘附促进泌乳分化，提示CTGF 在通过细胞外基质介导的信号传递中发挥重要作用[5]。

整联蛋白位于细胞表面，是一类重要细胞外基质受体家族，主要介导细胞与细胞外基质黏附，将细胞外基质和细胞骨架连接，实现细胞内外信号传递，Na 等研究证明整联蛋白对于乳腺泌乳分化必不可少[6]。同样，泌乳生物学经典研究表明催乳素、糖皮质激素、胰岛素联合处理发挥协同作用对于体外诱导奶牛乳腺上皮细胞（Dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs）功能性分化进而实现泌乳十分必要[7-9]。Wagner 等研究证明，在缺少层黏连蛋白情况下，添加催乳素，PRL/PRLRSTAT5 信号通路仅被短暂激活，实现STAT5 持续激活则需整联蛋白介导的细胞-细胞外基质相互作用[10]。在敲除整联蛋白β1 基因情况下，PRL/PRLR-STAT5信号通路被抑制，磷酸化的STAT5无法移位到细胞核，无法实现乳蛋白转录[6]。

在小鼠研究中，整联蛋白β1 介导的细胞黏附信号是乳腺实现泌乳分化必要条件，ILK 和Rac1是整联蛋白β1信号途径下游关键信号分子。Gao等研究发现CTGF通过其血小板反应蛋白1 型结构域和C端结构域与整联蛋白β1复合物相互作用[11]。此外，CTGF 通过整联蛋白介导的细胞黏附机制稳定细胞生存所需的细胞-细胞外基质相互作用，通过影响整联蛋白构型以及随之改变的β酪蛋白转录直接或间接实现其促进泌乳分化的功能[5]。在乳用经济动物（奶牛），关于CTGF泌乳调控作用尚无深入研究。因此，本试验以健康泌乳期DCMECs为研究对象，通过在体外培养过程不同阶段添加CTGF，探究其对DCMECs 增殖和凋亡及乳蛋白（β酪蛋白）表达合成转录和翻译水平的影响，通过检测分析乳蛋白表达关键信号途径PRL/PRLR-STAT5，整联蛋白β1及其下游关键信号分子变化，揭示CTGF对DCMECs 乳蛋白合成的调控作用及其信号途径，为泌乳生物学和乳腺功能调控作用奠定实验基础并提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

本试验以健康荷斯坦奶牛乳腺为研究对象。健康泌乳期荷斯坦奶牛乳房消毒后，按常规手术方法获取泌乳期乳腺组织，将乳腺组织剪成5 cm2组织块，10×双抗D-Hank's缓冲液清洗后，置于盛有缓冲液的广口瓶中立即带回实验室，用于奶牛乳腺上皮细胞分离纯化和原代培养。

1.1.2 主要试剂

CTGF（购自美国Fitzgerld 公司），DMEM/F-12培养基、0.25%胰酶-EDTA 消化液、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇（ITS-X）添加剂（购自美国Gibco公司），胎牛血清（购自法国WISENTING公司），氢化可的松、5×蛋白上样缓冲液、转膜液（购自北京Solarbio公司），催乳素（购自美国Abcam公司），Be⁃yoClickTMEdU-555 细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、SDS-PAGE快速凝胶试剂盒（购自北京碧云天公司），Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（购自北京TaKaRa 公司），ILK/RAC1/STAT5/p-STAT5抗体（购自美国Cell Signaling Tech⁃nology公司），β酪蛋白抗体（购自北京bioss公司）。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞培养与鉴定

采用胶原酶消化法分离纯化得到DCMECs，用含有10%胎牛血清DMEM-F12 培养基在37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养，DCMECs 经纯化培养后，通过角蛋白-18（Cytokeratin 18，CK18）鉴定上皮细胞特异性。冻存符合试验条件的DCMECs 备用，选用实验室冻存的4～8代DCMECs。

综上所述，本文主要就是基于移动通信行业的主要特点，然后从采购流程的制定、评标专家的抽取、评标室的配套设施等方面详细进行了评审标准化工作的分析探究，希望能够对移动通信行业有所帮助。此外，在接下来的研究中，还可以依据不同地区的运营商特点来进行细化，这样实际操作性将会更加的强。

制作细胞爬片，将传代细胞消化后接种至无菌盖玻片的六孔板中，待细胞长至50%～60%，弃去培养液，预冷PBS清洗3×5 min，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS漂洗3×5 min，5%BSA 的PBS/T 37 ℃封闭1 h，弃去封闭液，以1：200 比例加入AF488 标记的CK18 抗体，4 ℃避光孵育过夜，吸出一抗，PBS漂洗3×5 min，滴加DAPI（1 μg·mL-1）标记细胞核，室温避光染色10 min，弃去DAPI 染色液，PBS 漂洗3×10 min。在洁净载玻片上滴加适量抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片取出，倒置在抗荧光淬灭封片剂处，避免产生气泡，滤纸小心吸除盖玻片周围多余液体，指甲油封边。激光共聚焦显微镜观察DCMECs中CK18荧光情况。

1.2.2 细胞增殖EdU检测

收集对数生长期细胞，以1×105个·mL-1细胞密度接种于6 孔板（2 mL·孔-1）。绘制细胞生长曲线，待细胞进入对数生长期换液，分为两组：①CTGF组：无血清生长培养液（含ITS 的DMEM/F-12）+CTGF+EGF（CTGF为200 ng·mL-1、EGF为10 ng·mL-1）；②Control 组：无血清生长培养液（含ITS的DMEM/F-12）+EGF组（EGF为10 ng·mL-1），培养48 h收集样品。无血清生长培养液所需基本成分参考相关研究[12-13]。

每孔加入200 μL稀释后EdU培养液，37 ℃孵育2 h，预冷PBS 漂洗3×5 min，4%多聚甲醛室温固定15 min，吸出固定液，预冷PBS 漂洗3×5 min，0.3%TritonX-100室温孵育15 min，去除渗透液，PBS漂洗2×5 min，每孔加入500 μL Click反应液，室温避光孵育30 min，去除Click 反应液，PBS 漂洗3×5 min，加入1 μg·mL-1Hoechst 溶液1 mL，室温避光孵育10 min。吸出Hoechst 溶液，PBS漂洗3×5 min，倒置荧光显微镜观察。

1.2.3 细胞凋亡检测

收集对数生长期细胞，以1×105个·mL-1细胞密度接种于6孔板（2 mL·孔-1）。待细胞进入对数生长期换液，同样分为两组：① CTGF 组：无血清生长培养液（含ITS 的DMEM/F-12）+CTGF+EGF（CTGF为200 ng·mL-1、EGF为10 ng·mL-1）；②Control 组：无血清生长培养液（含ITS 的DMEM/F-12）+ EGF 组（EGF 为10 ng·mL-1），培养96 h 收集样品。

DCMECs 用不含EDTA 的胰酶消化，收集细胞，1 000 g 离心5 min，弃上清，加入200 μL An⁃nexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL An⁃nexin V-FITC，室温避光孵育15 min，上机前5 min加入5 μL 的PI 染色，补加300 μL Annexin V-FITC结合液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 反转录及qRT-PCR

收集对数期细胞，以1×105个·mL-1细胞密度接种于6 孔板（2 mL·孔-1）。待细胞生长至约80%融合换液，分为两组，①CTGF+HIP 组（氢化可的松、胰岛素、催乳素均为200 ng·mL-1，CTGF 为200 ng·mL-1，胰岛素以ITS 形式添加）；②HIP 组（氢化可的松、胰岛素、催乳素均为200 ng·mL-1，胰岛素以ITS形式添加），培养24 h收集样品。

将诱导24 h后细胞弃去培养液，预冷PBS漂洗两 次，采 用HiPure Total RNA Micro Kit（Magen，R4114-02）RNA提取试剂盒提取总RNA，使用核酸检测仪测定总RNA 的OD260/OD280值、浓度和纯度。提取RNA 保存于-80 ℃，用于后续试验。以提取RNA 为模板，用Prime ScriptTMRT Reagent Kit（Ta⁃KaRa，RR047A）反转录试剂盒制备cDNA，反应液总体系为20 μL，得到的RT 反应液使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，RR820A）试剂盒进行相关基因表达量检测。反应体系为20 μL，RT-PCR反应程序为95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s，40个循环，熔解曲线：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.5 蛋白免疫印迹

将诱导24 h后细胞弃去培养液，预冷PBS清洗3次，向各孔内滴加75 μL细胞裂解液，待细胞完全裂解，冰上放置5 min，之后将裂解液转移至1.5 mL离心管，4 ℃离心15 min，12 000 r·min-1，将上清液转移至新1.5 mL 离心管，加入等量2×上样缓冲液，煮沸10 min，超声3×15 s，用于后续试验。8%SDS-PAGE 凝胶电泳，根据蛋白Marker，湿转NC膜，避免产生气泡，TBST 配置的5%脱脂乳37 ℃封闭2.5 h，将NC 膜置于一抗4 ℃摇床孵育过夜，隔日，TBST漂洗3×10 min，取出NC膜置于二抗中37 ℃摇床孵育1 h，TBST 漂洗3×15 min，将NC 膜置于凝胶成像仪中，滴加适量超敏发光液，曝光。

1.3 统计分析

试验3 次重复，Excel 2019 统计原始数据，使用SPSS 26.0 分析数据显著性，GraphPad Prism 8.0作图，采用t 检验比较两组间数据，数据以“平均值±标准差”表示，P<0.05（*）表示差异显著，P<0.01（**）表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺上皮细胞生物学特性鉴定

原代奶牛乳腺上皮细胞经复苏并纯化后，采用免疫细胞荧光对其作CK18鉴定，通过激光共聚焦显微镜检测见图1，位于拉丝状细胞骨架的绿色荧光为CK18，蓝色卵圆形为细胞核，CK18阳性表达率表明已获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞，可用于后续试验。

表1 引物信息Table 1 Information for primers

图1 奶牛乳腺上皮细胞CK18鉴定Fig.1 Identification of CK18 in DCMECs

2.2 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

EdU 可掺入到新合成的DNA 中，细胞培养48 h后，利用EdU连接荧光基团，可通过荧光检测DCMECs 增殖情况。本试验每组选取5个视野，采用ImageJ 计算平均阳性率，结果取整数。荧光结果如图2所示，对照组EdU阳性率约2%，CTGF添加组阳性率约6%，是对照组3倍。结果可知CTGF促进DCMECs 增殖，增殖率明显高于阴性对照组，且差异极显著（P<0.01）。

2.3 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞的凋亡影响

细胞培养96 h 后，根据细胞凋亡原理用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，如图3 所示，Q2 与Q4之和代表细胞凋亡率，与阴性对照组相比，CTGF组细胞凋亡率降低0.8%，说明DCMECs 体外培养时，CTGF 可在一定程度内抑制细胞凋亡，有利于细胞存活，且差异极显著（P<0.01）。

2.4 CTGF 对奶牛乳腺上皮细胞β 酪蛋白表达的影响

为验证CTGF 对DCMECs 的β 酪蛋白基因表达和蛋白合成的影响，添加HIP 催乳复合物诱导DCMECs 分化，处理24 h 后收集细胞，提取两组细胞总RNA 和总蛋白，检测β 酪蛋白在mRNA和蛋白水平表达情况。如图4 所示，与对照组相比，β 酪蛋白编码基因CSN2 的mRNA 表达量极显著升高（P<0.01），β酪蛋白的蛋白表达量显著升高（P<0.05）。

图2 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响Fig.2 Effects of CTGF on proliferation of DCMECs

图3 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of CTGF on apoptosis of DCMECs

图4 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞β酪蛋白表达的影响Fig.4 Effects of CTGF on β casein expression in DCMECs

2.5 CTGF 对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白表达信号途径的影响

收集处理24 h 后细胞，提取总RNA 和总蛋白，检测两组DCMECs乳蛋白表达信号途径中关键信号分子在mRNA 和蛋白水平表达情况，结果如图5所示。

与对照组相比，CTGF组中ITGB1、ILK、RAC1、PRLR 基因表达量显著升高（P<0.05），STAT5a、STAT5b 基因表达量并无明显变化。整联蛋白β1、ILK、RAC1、PRLR蛋白表达量显著升高（P<0.05），STAT5蛋白表达量极显著升高（P<0.01），p-STAT5蛋白表达量无显著差异。

图5 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白表达信号途径的影响Fig.5 Effects of CTGF on milk protein expression signaling pathway in DCMECs

3 讨 论

随着越来越多研究证据出现，整联蛋白信号转导途径同乳蛋白合成之间的密切关系得以确立，学界对细胞外基质蛋白维持泌乳的作用有了新认识[6-9]。CTGF可通过未被发现的潜在受体发挥作用，还可通过自身结构域与多个配体结合，修饰多种生长因子和细胞因子[3]。Zhou等研究表明单独添加CTGF 刺激牛乳腺上皮细胞系MAC-T 增殖，但联合IGF-1 可抑制IGF-1 对MAC-T 细胞增殖作用，表明CTGF 作用的独特性和多重性[14]。Morrison等研究指出，在无血清培养条件下过表达CTGF 和/或添加EGF，可促进小鼠HC11 细胞增殖，并可与整联蛋白复合物直接结合，促进整联蛋白复合物催乳作用机制[5]。奶牛泌乳受多重激素

和生长因子作用，关于CTGF如何调节奶牛乳成分表达却鲜有报道。本试验利用体外培养系统，在排除血清激素和生长因子干扰条件下，探究外源CTGF 对DCMECs 增殖、凋亡以及乳蛋白成分β 酪蛋白表达的调控作用，发现CTGF在体外细胞培养不同阶段均显示出有利于DCMECs功能性泌乳分化的正向调控作用，具有应用于体外泌乳调控的潜在可能。

3.1 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

乳腺上皮细胞能够合成乳汁中的乳蛋白，而产奶量是由乳腺上皮细胞数目和分泌能力决定。CTGF 是CCN 家族成员，通过多条信号转导途径，调控细胞增殖、分化和凋亡[15-17]。Wang 等研究结果表明，CTGF 通过microRNA-19b-3p促进血管平滑肌细胞增殖[18]，Ren 等研究发现，重组人CTGF刺激可直接诱导小鼠HK-2细胞凋亡和纤维化，表明CTGF 对细胞进程的调控具有正、负调节作用，可能与CTGF作用的细胞和组织不同以及CTGF 表达水平有关[16]。Tong 等研究表明miR-148a 通过靶向整联蛋白抑制胶质母细胞瘤增殖和迁移，提示CTGF 调控细胞增殖和凋亡可能通过自身结构结合整联蛋白复合物也可能通过microRNA 间接调控整联蛋白途径，亦或两者兼有，还需进一步研究[19]。本研究通过免疫荧光和流式细胞术证明体外添加200 ng·mL-1人重组CTGF，可促进DCMECs 增殖，并抑制细胞凋亡，与前人研究结果相符[20]。然而CTGF 的这种作用是在单一浓度下得出，存在一定局限性，在体内不同时期CTGF 表达量可能不同，还需在明确其作用机制前提下，探索CTGF在生产实践中的合理应用。

3.2 CTGF对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响

乳腺上皮细胞对于基底膜和细胞外基质诱导信号的应答有助于其达到适宜泌乳分化程度，基底膜主要成分层黏连蛋白调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成，而整联蛋白β1 介导这一调控，使用整联蛋白β1 阻断剂AIIB2 处理后，其下游关键信号分子被阻断，β 酪蛋白含量显著降低[20-21]。Hen⁃desi等研究发现，CTGF在小鼠HC11乳腺上皮细胞泌乳分化过程中高度表达，转染编码CTGF的腺病毒载体后，小鼠乳腺上皮细胞表现出泌乳分化增强，过表达质粒载体诱导的CTGF升高也增加小鼠乳腺上皮细胞中整联蛋白β1 水平[22]。本研究中，添加与牛93% 同源性的人重组CTGF，整联蛋白β1 mRNA 和蛋白水平显著升高，与前人在啮齿类动物中研究结果一致[22]，表明CTGF 作为信号分子在泌乳分化中发挥重要作用且具有普遍性。同时，王春梅等研究也表明，整联蛋白β1 通过其下游信号通路影响STAT5 持续激活和易位入核，提示CTGF可能通过激活整联蛋白β1信号通路参与泌乳过程[20]。在整联蛋白信号转导过程中，ILK 和Rac1 通常被募集到其亚基胞内端活性区域，是整联蛋白下游关键信号分子[23]，参与小鼠乳腺泌乳分化，但在奶牛中作用尚不清楚。本研究中，利用HIP 诱导DCMECs 泌乳分化时，添加CTGF 显著促进整联蛋白β1、ILK 及RAC1 mRNA 和蛋白表达，表明在HIP 分化培养液诱导下，CTGF 具有明显整联蛋白β1信号途径调控作用，如3.1中所述，是一种直接作用还是间接作用，需进一步验证两者间蛋白质相互作用来证实。

催乳素对于PRL/PRLR-STAT5 信号通路的激活至关重要，PRLR与PRL结合，激活STAT5使其磷酸化并核转位。Li 等研究证明，FGF21 通过抑制STAT5 信号通路降低PDGF、VEGF 和CTGF 表达来降低细胞外基质表达[24]。同时，PRL/PRLRSTAT 通路也参与CTGF 诱导的瘢痕成纤维细胞增殖和分化过程，提示CTGF 与STAT 家族存在未知的相互作用关系。本研究中，添加CTGF显著增强PRLR mRNA 及其蛋白PRLR 表达水平，对STAT5 mRNA水平虽无显著影响，但显著上调STAT5蛋白水平。提示CTGF 与STAT5关联可能发生在翻译水平而非转录水平。该研究结果证明在HIP复合物诱导泌乳分化基础上，外源添加CTGF 显著上调CSN2 mRNA 及其蛋白产物β 酪蛋白表达水平，显著上调整联蛋白β1 信号通路Integrinβ1/ILK/RAC1关键信号分子mRNA 和蛋白表达水平，显著上调PRL/PRLR-STAT5 信号通路中PRLR 的mRNA 和蛋白表达水平，显著上调STAT5 蛋白表达水平。综上，CTGF 作为一种重要生长因子，可在体外显著促进DCMECs增殖，抑制其凋亡，上调β 酪蛋白表达，（直接或间接）参与整联蛋白β1信号途径Integ⁃rin β1/ILK/RAC1 与催乳素信号途径PRL/PRLRSTAT5的体外串话。

4 结 论

外源CTGF调控奶牛乳腺上皮细胞生长，促进乳蛋白表达，其作用依赖于整联蛋白β1信号途径In⁃tegrin β1/ILK/RAC1 和催乳素信号途径PRL/PRLRSTAT5。