128份番茄种质资源主要农艺性状鉴定及抗病性评价

许向阳 ，赵 爽，何梦曦，闫成革 ，王凯慧，赵婷婷，李景富，杨欢欢，姜景彬，张 贺

（1.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030；2.农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030；3.同江市三村镇乡村振兴发展服务中心，黑龙江 同江 156400）

番茄（Solanum lycopersicum）果实颜色艳丽，营养价值高，作为一种食用性果蔬，因其独特风味和丰富口感备受人们喜爱。目前番茄是种植面积最广的蔬菜作物之一，已成为我国蔬菜产业重要组成[1]。随着生活水平日益提高，人们对番茄品质需求越来越多样化，不仅要求营养价值高，在果实外观和口感上也有一定要求。因此培育更多品质优良番茄品种是育种者的工作重点。但番茄是自花授粉植物，长时间人工培育与选择造成番茄遗传背景相对狭窄。因此，番茄种质资源遗传多样性研究对当前育种工作具有重要意义[2]。表型性状多样性研究是遗传多样性分析和评价常用方法之一[3]。通过直观形态学方法分析种质资源遗传多样性，可更加全面了解番茄种质资源丰富程度。

番茄生长发育过程普遍发生的病虫害达40 余种，严重影响番茄品质和产量[4]，甚至导致植株大面积死亡，造成巨大经济损失[5]。例如由叶霉病菌导致的番茄叶霉病，该病害严重时危及番茄嫩茎、果柄和果实，使植株呈黄褐色干枯状，并造成果实大量脱落；由斑萎病毒导致的番茄斑萎病毒病，该病害导致植株黄化枯萎、叶片以及生长点坏死，茎部、果实等出现黑色斑点；此外，番茄黄化曲叶病毒病在我国发生率较高、分布范围较广，对番茄品质和产量影响较大，甚至导致番茄植株死亡。种植和管理技术以及喷施农药防治病虫害效果有限，且易对生态环境造成危害。因此，培育抗多种病害番茄品种十分重要[6]。人工接种鉴定是番茄种质资源抗病性研究常规方法，通常一次接种一种病害，多种病害同时接种易出现相互影响，结果不准确，因此多抗材料鉴定存在困难，另外人工接种鉴定时间周期较长，易受环境条件影响，鉴定效率低。随着生物技术进步，分子标记辅助选择育种可降低番茄品种选择盲目性，有效缩短育种时间，提高育种效率，加速优质番茄种质资源利用和新品种培育[7]。张育垚等开发抗叶霉病基因Cf-5 的SNP 分子标记，奠定分子标记辅助选择基础[8]。胡恩美等从野生番茄内筛选出对番茄黄化曲叶病毒具有抗性的基因，分别是Ty-1、Ty-2、Ty-3……Ty-6 等，其中Ty-1，Ty-2和Ty-3基因在优质种质资源研究应用广泛[9]。在抗番茄斑萎病毒病研究中，因Sw-5 基因对番茄斑萎病不同小种表现一定的广谱抗性[10]，Latham等利用Sw-5 序列创建一个共显性SCAR 标记，利用该标记筛选结果稳定性最强，为抗番茄斑萎病育种研究奠定基础[11]。

综上，本试验观察分析128份番茄种质资源材料农艺性状，利用实验室已建立检测体系的Cf-5、Ty-1、Ty-2、Ty-3、Sw-5 基因进行分子标记抗病鉴定，筛选出农艺性状优良且抗多种病害的番茄种质资源，为番茄育种研究提供优异种质资源以及理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试番茄材料

供试番茄种质资源材料有128份，为东北农业大学番茄研究所2020 年新引进番茄种质资源，编号为20001～20128。种植于向阳农场塑料大棚内，选取田间生长健壮番茄植株，每个编号随机选取3株番茄植株采集叶片，置于1.5 mL 离心管，放入液氮罐中迅速冷却，-80 ℃低温保存。

1.1.2 引物

Cf-5、Ty-1、Ty-2、Ty-3、Sw-5 基因分子标记引物见表1，均为实验室前期已建立检测体系标记。

1.2 方法

1.2.1 材料种植及重要农艺性状调查统计

2020 年春季将128 份材料分不同地块（向阳农场塑料大棚）种植3 次重复，采用目测直观法和称重法对128份番茄材料生长习性、果形、成熟期果色、果肩有无、单果重5个育种关注度较高的农艺性状观察与统计。并按照《番茄种质资源描述规范和数据标准》[17]对番茄种质资源材料5项指标进行赋值（见表2），统计各质量性状频率分布（见表3），计算其遗传多样性指数，公式如下：H'=-ΣPilnPi，其中，i为某一性状分级，Pi为频率，ln为自然对数。数量性状分级参照陈雪燕等计算方法[18]，按数量性状平均值（X）和标准差（S）将数据分为10级，从第一级Xi<（M-2S）到第10级Xi≥（M+2S），中间每级相差0.5 S，每一组相对频率用于计算多样性指数。

1.2.2 样本采集以及基因组DNA提取

每个番茄品种随机选择3株植株作3次重复，每株取0.2 g番茄叶片作为一个样本，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存备用。采用CTAB法提取番茄叶片总DNA[19]。

1.2.3 128份材料抗病性分子标记鉴定

针对待检测的128份番茄材料，采用实验室前期已优化的分子标记鉴定体系，对Cf-5、Ty-1、Ty-2、Ty-3、Sw-5这5个抗病基因进行鉴定。PCR反应体系为20 μL，包含Master Mix 8 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，退火温度根据各引物设定（见表1）、72 ℃延伸60 s，共35 个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。产物电泳拍照统计。

表1 分子标记引物列表Table 1 List of molecular marker primers

表2 番茄农艺性状赋值情况Table 2 Assignment of tomato agronomic characters

表3 番茄质量性状频率分布Table 3 Frequency distribution of tomato quality traits

2 结果与分析

2.1 主要农艺性状调查结果

本试验调查128份番茄种质资源5个主要农艺性状（见表4）。结果表明，不同种质材料农艺性状之间表现出一定差异性。番茄植株生长类型分为两类，有限生长型和无限生长型；成熟期果实颜色分为红色、粉色和黄色，其中红色果数量最多；果形包括圆形、高圆、卵圆、长圆四类，以圆果形为主；番茄果实重量分布差异较大，最小单果重仅为11 g，最大为260 g；番茄幼果有无绿肩数量分布较为均匀，无绿肩材料为71 份，有绿肩材料为57份。

2.2 表型性状多样性分析

分析128份番茄种质资源5个市场关注度较高农艺性状，结果表明，128份番茄材料变异系数范围为28%～101%，多样性指数为0.69～1.51（见表5）。在果实相关4 个性状中，果形与单果重多样性指数均大于1，且除熟果色外，其余性状变异系数均≥30%，其中，单果重变异系数最大为101%，说明性状遗传多样性较为丰富，且变异程度较大。综合分析各性状平均值、最大值、最小值、标准差、变异系数以及多样性指数，可看出供试番茄材料具有较强遗传改良潜力。

2.3 聚类分析

采用欧式平均距离方法作组间聚类分析，将128份番茄种质资源根据其农艺性状特点分成两大类结果见图1。第Ⅰ类群包括99份材料，其生长类型为有限生长型和无限生长型，果形以卵圆和圆形为主，且均为单果重在100 g以下小番茄，有绿肩数量略少于无绿肩；第Ⅱ类群包括29份材料，又分为ⅡA 和ⅡB 两个亚群。其中ⅡA 类群包括17 份材料，熟果色主要为红色，果形以圆和长圆为主，单果重在150 g以上，大多数果实无绿肩，ⅡB类群包括12份材料，熟果色为红色，果形以卵圆和高圆为主，多为大果番茄，大多数果实无绿肩。

图1 农艺性状聚类分析Fig.1 Cluster analysis of agronomic characters

2.4 128份材料抗病性分子标记鉴定结果分析

利用Cf-5 基因分子标记，对128 份番茄材料作分子标记鉴定。如图2所示，显示出条带长度约为490 和256 bp 时，为不含Cf-5 抗病基因材料；显示出条带长度约为480和256 bp时，为含有Cf-5抗病基因材料。在所有供试番茄材料中，15 份材料含有Cf-5 抗病基因，113 份材料不含Cf-5 抗病基因（见表6）。

利用Sw-5 基因分子标记，对128 份番茄材料作分子标记鉴定。如图3所示，显示出条带长度约为574 bp 时，番茄材料基因型为AA；显示出条带长度约为574 和464 bp 时，番茄材料基因型为Aa；显示出条带长度仅有510或464 bp时，则基因型为aa。在所有供试番茄材料中，6 份材料为Aa，120份材料为aa（见表6）。

利用Ty-1、Ty-2、Ty-3 基因分子标记，对128 份番茄材料作分子标记鉴定。结果如图4 所示，A 为Ty-1 基因显示出条带，B 为Ty-2 基因显示出条带，C 为Ty-3基因显示出条带。当图4A 中条带长度约为303 和95 bp 时，番茄材料基因型为AA，共有13 份；当其长度约为398 和303 bp 时，番茄材料基因型为Aa，共有4 分；当其长度仅有398 bp 时，则基因型为aa，共有111 份。当图4B中条带长度为900 bp 时，番茄材料基因型为AA；当其条带长度约为900和800 bp时，番茄材料基因型为Aa，共有7 份；当其条带长度仅有800 bp时，则基因型为aa，共有121 份。当图4C 中条带长度约为320 bp 时，番茄材料基因型为aa，共有114份；当其条带长度约为630 bp时，番茄材料基因型为Ty-3a，共有14份（见表6）。

图2 Cf-5抗病基因分子标记鉴定Fig.2 Molecular marker identification of Cf-5 diseaseresistance gene

图3 Sw-5抗病基因分子标记鉴定Fig.3 Molecular marker identification of Sw-5 disease resistance gene

图4 Ty-1、Ty-2和Ty-3抗病基因分子标记鉴定Fig.4 Molecular marker identification of Ty-1,Ty-2 and Ty-3 disease resistance gene

表6 128份番茄材料抗病性鉴定结果Table 6 Disease resistance identification results of 128 tomato materials

续表

续表

利用实验室已优化的Cf-5、Ty-1、Ty-2、Ty-3、Sw-5基因分子标记鉴定体系对128份番茄种质资源材料作分子标记鉴定，得到每份材料5个分子标记鉴定结果。研究表明，在所有番茄材料中同时含有3 种抗病基因材料为2 份，含有2 种抗病基因材料为12份。

3 讨 论

3.1 128份番茄种质材料整体评价

种质资源是育种基础，筛选更多优质资源是番茄育种工作的重要内容。本试验选择128份番茄种质材料调查农艺性状及检测分子标记。研究发现，番茄种质农艺性状变异系数和多样性指数均较大，其中变异系数最大的为番茄单果重，达到101%，多样性指数大于1 的为果形和单果重。王娟等研究燕麦表型表明，一般情况下，变异系数大于10%时，表示样本间差异性较大[20]。说明128份番茄种质资源具有较高水平表型性状多样性，果实颜色丰富，形态各异，具有较大遗传改良潜力。抗病基因分子标记鉴定结果显示，大部分材料含有至少1种抗病基因，最多同时含有检测范围内3种抗病基因，说明材料抗病性较好。

3.2 分子标记辅助选择与农艺性状调查相结合

目前，培育新番茄品种、创制新番茄种质最有效途径，就是将分子标记辅助选择与田间观察相结合。例如，欧青青借助分子标记辅助选择技术鉴定筛选具有抗病性樱桃番茄品种，同时，鉴定筛选番茄品种农艺性状，获得农艺性状优良且抗多种病害品种[21]。朱龙英等利用分子标记辅助育种手段，育成樱桃番茄新品种‘沪樱6号’，该品种产量高、风味好、品质佳且抗番茄黄化曲叶病毒[22]。dCAPS功能性分子标记技术辅助选择与田间观察相结合方法已在番茄、大麦、大豆和水稻等植物中广泛应用[23]。本试验利用抗病性基因Cf-5、Ty-1、Ty-2、Ty-3、Sw-5 检测128 份番茄种质资源，筛选出含2 种以上抗病基因种质资源14 份，与田间农艺性状调查结果相结合，在128份供试番茄材料中挑选出色泽光亮、形状适宜且具有抗2种及2种以上病害多抗性材料。分子标记辅助选择具有快速、准确的优点，且不受外界环境、主观意识等因素影响。因此，将分子标记辅助选择与农艺性状调查相结合，可显著提高番茄种质材料育种效率。

4 结 论

本试验共对128份番茄种质资源开展农艺性状分析及抗病性分子标记鉴定，研究表明番茄种质资源表型性状变异系数较大，且含2种以上抗病基因番茄种质资源共有14 份，具有作为优良育种亲本潜力，对番茄品种选育具有较高利用价值。