固定化反硝化菌的脱氮性能

闫征楚， 董红红， 周小峰

(深圳市长隆科技有限公司 万葳生物事业部，广东 深圳 518116)

近年来，工业发展迅速，金属制品应用范围越来越广，利用机械加工、电镀及冶炼对金属表面处理时产生大量洗涤、冲淋废水[1].这些废水中存在多种有机物、高浓度的磷和氮以及有毒有害的重金属[2-3].其中，高浓度的氮不仅会引起水体的富营养化[4]，还会对人体健康造成严重威胁.因此，对此类废水进行脱氮处理至关重要.目前国内外对金属表面处理废水的处理以化学法、生物法、生化结合法为主[5-6].

金属表面处理废水中的氮多以硝态氮的形式存在，化学法可以有效地脱除水中的高浓度磷及部分有毒有害物质，但不能够实现将硝态氮有效脱除；传统的生物脱氮法由于脱氮法菌群生长较慢，且微生物容易随水流失，难以维持生物反应器内较高的生物菌群浓度，因此受限于抗负荷冲击能力差、容积负荷率低等因素而未能大规模应用于金属表面处理废水的脱氮处理.采用固定化技术包埋活性污泥或菌剂的技术能够克服传统脱氮的不足[7].固定化微生物主要有表面吸附固定、交联固定化、包埋固定化和自身固定化等几种方法[8-10].包埋固定化技术能针对性地固定有效菌群，选择性地提高泥龄，保持有效菌种的活性，进而提高脱氮效率，降低处理费用.

本文中，笔者利用聚乙烯醇等通过包埋方式固定化反硝化菌，制备了一种微生物载体，通过考察碳酸氢钠溶液浓度对载体的影响，对其生物传质性能进行了验证；利用所制备微生物载体对金属表面处理废水进行脱氮处理，通过考察处理过程中碳氮比、载体填充率等因素对水中氨氮、硝态氮、亚硝态氮、总氮去除效率的影响，对其脱氮性能进行了评价.

1 材料与方法

1.1 材 料

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)，分析纯，平均聚合度为1 750±100、醇解度>98 %，国药集团化学试剂有限公司；海藻酸钠(sodium alginate，SA)，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均选用分析纯；固定化过程用水为蒸馏水或去离子水.反硝化细菌选用巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)FX-1.

实验所用菌体培养物(底泥)及污水采自深圳市某环境集团污水处理车间A/A/O处理工艺A池，水中金属已通过投加重金属捕捉剂将铜离子质量浓度降至约0.050 8 mg/L，镍离子质量浓度降至约0.011 3 mg/L，总铬质量浓度降至约0.213 mg/L，达到《电镀污染物排放标准》GB 21900—2008表3中总铜0.3 mg/L、总镍0.1 mg/L、总铬为0.5 mg/L的排放标准.

1.2 实验方法

1.2.1 反硝化菌固定化方法

将一定量聚乙烯醇与海藻酸钠加入水中，保持加热30 min使其充分溶解，冷却至室温得到第1凝胶溶液；将菌体培养物经3 000 r/min离心后，倒掉上清液，取底部菌体用蒸馏水重悬得到菌液；将菌液、碳酸氢钠与第1凝胶溶液搅拌混合均匀，搅拌转速为50～80 r/min，得到第2凝胶溶液；采用末端带管口的蠕动泵将第2凝胶溶液逐滴滴入一定浓度的氯化钙与硼酸的水溶液中，静置15 h，得到具有多孔隙结构的包埋固定化微生物载体凝胶小球.将包埋固定化微生物载体置于一定浓度的磷酸二氢钾溶液缓冲液中浸泡0.5～2 h，用水清洗后保存备用.

1.2.2 生物载体传质性能验证方法

制备包埋固定化微生物载体过程中设置碳酸氢钠体积分数分别为0,0.3 %,0.6 %及0.9 %，取10 mL尺寸基本一致的包埋固定化微生物载体放入盛有2 mg/L亚甲基蓝溶液的取样瓶中，置于摇床中以恒定转速250 r/min摇3 h后得到吸附后溶液，在665 nm波长下测定吸附后亚甲基蓝溶液的吸光度，吸光度大小与包埋固定化微生物载体的传质性能成反比.

1.2.3 含氮污水处理方法

利用所制备的包埋固定化微生物载体对污水中的含氮化合物进行降解：所取污水温度为30 ℃，pH值为7～9，初始硝态氮质量浓度为126.3 mg/L.向100 mL测试瓶中加入10～30 mL的包埋固定化微生物载体，再分别向每个测试瓶中加入所取污水及无水乙酸钠至总体积为100 mL，污水中的碳氮质量浓度比为1∶3.将测量瓶置于摇床(200 r/min)培养0，5，10，15，20 h，考察碳氮质量浓度比、包埋固定化微生物载体的填充率等因素对污水中氨氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)、亚硝态氮(NO2--N)、总氮(TN)以及化学需氧量(COD)的影响.将上述结果3次平行实验平均数，进行方差计算.

1.3 测试方法

亚甲基蓝，水中NH4+-N，NO3--N，NO2--N，TN均采用紫外/可见光分光光度法进行测定；化学需氧量(COD)采用重铬酸钾快速测定法进行测定.

1.4 数据分析方法

通过t检验及方差分析等统计学Origin(美国OriginPro)方法分析不同数据组间差异的显著性，显著水平设置为0.05，即当P<0.05时数据间存在显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 碳酸氢钠体积分数对生物载体的影响

碳酸氢钠体积分数对生物载体的影响如表1及图1所示.通过对比使用不同浓度碳酸氢钠溶液所制备的固定化微生物载体吸附亚甲基蓝后的切面颜色、吸附后亚甲基蓝溶液的吸光度、载体物理性质(成球难易、粘连情况、机械强度与稳定性)的结果可知，当φ(碳酸氢钠)<0.6 %时，微生物载体切面呈白色或浅蓝色，亚甲基蓝溶液吸光度达到0.6以上，说明载体所吸收的色素较少，传质性能较差，同时载体的机械强度与稳定性较差；当φ(碳酸氢钠)=0.6 %时，微生物载体切面露白较少，亚甲基蓝溶液的吸光度骤降至0.331，说明载体吸收了大量色素，传质性能良好，且此时载体成球、机械强度和稳定性良好；当φ(碳酸氢钠)继续增至0.9 %，虽然载体传质性能随之增强(切面呈深蓝色，吸光度仅0.185)，但此时载体较难成球，尺寸差距较大，并存在滋芽现象.因此，为保证包埋固定化微生物载体的综合性能，制备过程中第2凝胶溶液中碳酸氢钠的最佳体积分数为0.6 %.

表1 样品评价表Tab.1 The Sample Evaluation Sheet

图1 包埋固定化微生物载体吸附亚甲基蓝剖视图Fig.1 Cross-section Views of the Embedded Immobilized Microbial Carrier Adsorbing Methylene Blue

利用产气化合物溶液与交联剂中的硼酸反应生成气体，使所制备的包埋固定化微生物载体具有多孔隙结构，进而增强了微生物载体的传质能力.宋漫利等[11]在研究假单胞菌固定化时，使用了海藻酸钠和聚乙烯醇作为包埋材料，但未加入产气化合物碳酸氢钠，因此在固定化小球表面孔隙分布(吸附能力)有差异.普利锋等[12]在类似研究中也证明了在交联剂中引入碳酸氢钠后的生物活性较不引入时更高.

2.2 包埋固定化微生物载体处理含氮污水的评价

2.2.1 碳氮质量浓度比的影响

设置载体填充率为20 %，考察不同碳氮质量浓度比对微生物载体处理水中硝态氮的影响，结果如图2所示.随着碳氮质量浓度比从0升至2.0，硝态氮去除率有显著提升(P<0.05).经过15 h处理后，碳氮质量浓度比为0，水中硝态氮质量浓度由126.3 mg/L下降至90.5 mg/L，硝态氮去除率仅为21.9 %；当碳氮质量浓度比逐渐升高至2.0，水中硝态氮质量浓度下降至0.6 mg/L，硝态氮去除率高达99.5 %.随着碳氮质量浓度比继续升高或时间继续延长，硝态氮去除率变化并不明显(P>0.05).因此，选取2.0为去除硝态氮最适碳氮质量浓度比，此时硝态氮脱除率达到99.5 %.

设置载体填充率为20 %，考察不同碳氮质量浓度比对微生物载体处理水中氨氮的影响，结果如图3所示.碳氮质量浓度比与氨氮脱除速率成正比，且体系中氨氮质量浓度一直维持在较低水平(0.2 mg/L以下).在碳氮浓度质量比为2.0时，整个处理过程中氨氮的质量浓度一直处于较低水平(0.1 mg/L以下).

图2 碳氮质量浓度比对水中硝态氮去除率的影响Fig.2 Effect of Mass Concentration Ratio of C/N on the Treatment of Nitrate Nitrogen in Water

图3 碳氮质量浓度比对水中氨氮去除率的影响Fig.3 Effect of Mass Concntration Ratio of C/N on the Treatment of Ammonia Nitrogen in Water

图4 碳氮质量浓度比对水中亚硝态氮的影响Fig.4 Effect of C/N Ratio on Nitrite Nitrogen in Water

设置载体填充率为20 %，考察不同碳氮质量浓度比对微生物载体处理水中亚硝态氮的影响，结果如图4所示，随着质量碳氮浓度比从0升至2.0，亚硝态氮去除率有显著提升(P<0.05).在处理小于5 h时，受载体空间限制，亚硝态氮质量浓度有一定量的积累，但随着处理时间的延长(5～15 h)，亚硝态氮质量浓度逐渐降低.当碳氮质量浓度比为2.0，亚硝态氮去除率高达99.8 %.

设置载体填充率为20 %，考察不同碳氮质量浓度比对微生物载体处理水中总氮的影响，结果如图5所示.经过15 h处理后，随着碳氮质量浓度比从0升至2.0，总氮去除率有显著提升(P<0.05).当碳氮质量浓度比逐渐升至2.0，水中硝态氮质量浓度下降至1.3 mg/L，总氮去除率高达99.0 %.随着碳氮质量浓度浓度比升高或时间延长，总氮去除率变化并不明显(P>0.05).因此，选取2.0为去除总氮最适碳氮质量浓度浓度比，此时硝态氮脱除效率达到99.0 %.

设置载体填充率为20 %，考察不同碳氮质量浓度比对水中COD的影响，结果如图6所示.随着处理时间的增加，COD均呈现下降的趋势.其中，当碳氮质量浓度比为0，1.0，1.5时，由于碳氮质量浓度比不足，COD消耗的比较快.当碳氮质量浓度比为2.0，处理后ρ(COD)为151.8 mg/L，低于原水中的ρ(COD)(209.6 mg/L).而碳氮质量浓度比增加至2.5和3.0时，由于碳氮质量比浓度较大，因此会有未消耗的碳源，增加出水ρ(COD).

图5 碳氮质量浓度比对水中总氮去除率的影响Fig.5 Effect of Mass Concentration Ratio of C/N on the Treatment of Total Nitrogen in Water Treated

图6 碳氮质量浓度比对水中COD去除率的影响Fig.6 Effect of Mass Concentration of Ratio C/N on the Treatment of COD in Water

综上所述，基于碳氮质量浓度比对硝态氮、氨氮、亚硝态氮、总氮及COD的影响及处理成本考虑，选取最适碳氮质量浓度比为2.0，处理时间为15 h，此时硝态氮、亚硝态氮及总氮去除率可达到最佳，分别为99.5 %，99.8 %及99.0 %.谭佑铭等[13]在固定化反硝化菌的反硝化特性及影响因素的研究中得出了相似的结论，即随着碳氮质量浓度比的升高所制备固定化小球处理硝态氮的效率逐渐升高，且达到一定比例后去除效率趋于平缓.

2.2.2 载体填充率的影响

设置碳氮质量浓度比为2.0，考察不同载体填充率对微生物载体处理水中硝态氮的影响，结果如图7所示.随着载体填充率从0升至20 %，硝态氮去除率有显著提升(P<0.05).经过15 h处理后，当载体填充率为0，硝态氮质量浓度由147.9 mg/L降至140.2 mg/L，硝态氮去除率仅为5.2 %；当载体填充率逐渐升至20 %，硝态氮质量浓度降至5.4 mg/L，硝态氮去除率高达96.3 %.随着载体填充率继续升高或时间继续延长，硝态氮去除率变化并不明显(P>0.05).因此，选取20 %为去除硝态氮最适载体填充率，此时硝态氮脱除效率为96.3 %.

设置碳氮质量浓度比为2.0，考察不同载体填充率对微生物载体处理水中氨氮的影响，结果如图8所示.载体填充率与氨氮脱除速率成正比，且体系中氨氮质量浓度一直维持在较低水平(0.15 mg/L以下).在载体填充率为20 %时，整个处理过程中氨氮的质量浓度一直处于较低水平(0.1 mg/L以下).

设置碳氮质量浓度比为2.0，考察不同载体填充率对微生物载体处理水中亚硝态氮的影响，结果如图9所示.在整个处理过程中，亚硝态氮的质量浓度都保持较低水平(0.5 mg/L以下).

设置碳氮质量浓度比为2.0，考察不同载体填充率对微生物载体处理水中总氮的影响，结果如图10所示.随着载体填充率从0升至20 %，总氮去除率有显著提升(P<0.05).经过15 h处理后，当载体填充率为20 %，水中硝态氮质量浓度降至6.5 mg/L，总氮去除率高达95.7 %.随着载体填充率继续升高或时间继续延长，总氮去除率变化并不明显(P>0.05).因此，选取20 %为去除总氮最适载体填充率，此时硝态氮脱除效率为95.7 %.

设置碳氮质量浓度比为2.0，考察不同载体填充率对处理水中COD的影响，结果如图11所示.随着处理时间的增加，ρ(COD)均呈现下降的趋势.其中，当载体填充率为0，10 %，15 %时，由于载体填充率不足，总氮降解速率较小，因此COD消耗的较少.当载体填充率为20 %，25 %，30 %时，处理后对应ρ(COD)分别为121.9，120.4，112.9 mg/L，均低于原水中的ρ(COD)(188.2 mg/L)，随着处理时间继续延长，ρ(COD)变化不明显(P>0.05).

图8 填充率对水中氨氮去除的影响Fig.8 Effect of Carrier Filling Rate on the Treatment of Ammonia Nitrogen in Water

图9 填充率对水中亚硝态氮去除的影响Fig.9 Effect of Carrier Filling Rate on the Treatment of Nitrite Nitrogen in Water

图10 填充率对微生物载体处理水中总氮的影响Fig.10 Effect of Carrier Filling Rate on Total Nitrogen in Water Treated

图11 填充率对水中COD的影响Fig.11 Effect of Carrier Filling Rate on COD in Water

综上所述，基于载体填充率对硝态氮、氨氮、亚硝态氮、总氮及COD的影响及处理成本考虑，利用巴利阿里假单胞菌FX-1进行固定反硝化，选取最适载体填充率为20 %，处理时间为15 h，此时硝态氮及总氮去除率可达到最佳，分别为96.3 %和95.7 %.结果与宋佳强等[14]在利用固定化技术进行反硝化脱氮的研究的结论一致，即载体填充率同为20 %.

3 结 论

通过包埋方式固定化反硝化菌，制备了一种微生物载体，制备过程中(第2凝胶液中)碳酸氢钠溶液最适体积分数为0.6 %，此时载体生物传质性能最强；利用所制备微生物载体对金属表面处理废水进行脱氮处理，当碳氮质量浓度比为2.0，载体填充率为20 %时，废水中氨氮质量浓度低于0.1 mg/L，硝态氮、亚硝态氮、总氮处理效率均高于95 %.因此，固定化反硝化菌能够克服传统生物脱氮微生物易流失、难维持较高生物浓度、抗负荷冲击能力差、容积负荷率低等缺点，有效脱除污水中各项氮指标.在微生物水处理领域中，此项技术及相应产品具备巨大的研究价值和应用前景.