探讨miRNA 标记物在骨髓间充质干细胞对成骨诱导分化过程中的调控机制

黄志刚，马克，刘晶

深圳市第三人民医院骨科，广东深圳 518100

当前，临床治疗中移植的成骨细胞主要源自自体成骨细胞及骨髓间充质干细胞诱导分化而得到的细胞[1]。骨髓间充质干细胞的优点是自我更新能力强且便于取材，应用前景更为广阔。目前，临床对于骨髓间充质干细胞对成骨细胞诱导分化的机制尚无统一定论，并且诱导分化出来的细胞大都是成骨样细胞[2]。miRNA 属于具备一定调控作用的微小分子，其调控肿瘤发生发展的作用已经得到证实[3]。有研究指出，miRNA 可调节骨及成骨细胞分化，但得到miRNA 靶基因的确切数据很少，尚无法明确miRNA 在成骨细胞诱导分化中发挥的具体调控机制[4]。该次研究选取2016年6月—2018年1月该院收治的40例脊柱结核患者为研究对象，通过基因芯片技术对骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞过程中miRNA 差异表达进行观察，并筛选出特异性miRNA，以明确其确切的调控机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院收治的40例脊柱结核患者进行该次研究。纳入标准：生长发育正常；年龄≥18岁；经临床表现、实验室检查及影像学检查确诊；均接受手术治疗；脊柱结核活动期同时具备严重骨质破坏、较大寒性脓肿；行彻底病灶清除术；组织病理学检查结果发现干酪样物质或朗罕斯细胞和/或结核杆菌组织标本培养阳性；无其他可疑疾病；患者知晓该次研究内容并签订知情同意书。排除标准：早期影像学表现不明显者；合并其他（脊柱外）脏器结核病者；骨病治愈型、静止型脊柱结核者；行器官移植、同种异体组织移植及人工假体植入者；合并HIV 等自身免疫性疾病者。该研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器TGF-β1、异硫氰酸荧光素、CD54-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、兔抗大鼠神经巢蛋单抗、兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶单抗、PCR 引物、倒置相差显微镜、BIGeneAmp9700PCR 仪、FC500MCL/MPL流式细胞仪。

1.2.2 骨髓间充质干细胞分离与培养抽取受试者股骨骨髓，通过磷酸盐缓冲液在肝素抗凝管中进行稀释，将人淋巴细胞分离液加入提取液中，离心（1 400 g）10 min 后取中间层，应用PBS 进行两次冲洗，继而接种到培养瓶中。在37℃、4%CO2、94%培养湿度的条件下进行培养，培养密度维持在1×109/L，培养3 d 后换液，之后每间隔2 d 换液1 次。换液后对细胞生长情况进行显微观察，细胞单层达到80%融合度后实施胰蛋白酶消化，并以1:2 的比例进行传代培养，培养代数分别记为P1、P2、P3、P4。

1.2.3 骨髓间充质干细胞鉴定应用PBS 对P4代骨髓间充质干细胞洗涤3次，细胞浓度维持在1×106个/L，将其制成1 mL 细胞悬液并放置在EP 管中，继而分别加入5 μl 异硫氰酸荧光素、CD54-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC 单抗，同时设定同型阴性对照，在37℃条件下反应半小时，离心（800 g）20 min，应用PBS对细胞重悬，通过流式细胞仪实施检测。

1.2.4 骨髓间充质干细胞成骨诱导培养及鉴定以5×106个/L的浓度P4代骨髓间充质干细胞1 mL，将基础培养液加入后按其组成把细胞分为对照组和阳性组，两组细胞进行3 d 的培养后进行培养液更换，之后每间隔2 d 进行一次更换，培养3 周。结束诱导后去除培养液，应用PBS 冲洗3 次，应用4%多聚甲醛进行20 min固定，继而石蜡包埋并常规切片，甲苯胺蓝染色。

1.2.5 基因芯片检查收集成骨细胞诱导前（T0）及培养后1 周（T1）、2 周（T2）、3 周（T3）的骨髓间充质干细胞，应用一步法进行总RNA 提取，荧光标记扩增完成后的RNA 样品，实施激光扫描，通过SAM version 2.1 软件对成骨细胞诱导后有差异表达的miRNA进行分析。

1.2.6 miRNA 验证 把成骨细胞诱导培养3 周的总RNA 反转录为cDNA，以实时定量miRNA 为引物、cDNA 为模板实施PCR 反应，设置反应条件如下：保持引物浓度在0.3 μmmol/L左右，96℃条件变性20 s，然后60℃条件退火45 s，共进行35个循环。

1.3 统计方法

采用SPSS 21.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料用（±s）表示，采用t检验；一致性采用Kappa检验，≤0.4Kappa值≥0.75 表示一致性极好，Kappa值＜0.75 表示一致性较高，Kappa值＜0.4 表示一致性较差，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化期间筛选出差异表达miRNA，其中，miR-130b、miR-193b 为表达 上 调miRNA，miR-135、miR-424 为 表 达 下 调miRNA。于原样本中实施实时荧光定量PCR 验证，验证结果同基因芯片筛选结果存在高度一致性（Kappa=0.913，P＜0.05）。见表1。

表1 实时荧光定量PCR检测miRNA表达(±s)

表1 实时荧光定量PCR检测miRNA表达(±s)

注：△表示与T0相比，P＜0.05

miRNA miR-130b miR-193b miR-424 miR-135 T0 1.00±0.06 1.00±0.12 1.00±0.15 1.00±0.15 T1（1.71±0.15）△（1.07±0.14）△（0.95±0.05）△（0.66±0.04）△T2（1.83±0.21）△（1.48±0.16）△（0.87±0.03）△（0.62±0.04）△T3（2.75±0.23）△（1.93±0.22）△（0.68±0.02）△（0.55±0.04）△

3 讨论

在全身骨及关节结核病中，脊柱结核的患病率位居首位，且最为常见的患病部位为胸腰椎段，脊柱结核在各年龄段人群中均有发病的可能，而高发人群是青壮年，由于脊柱结核病存在破坏性生长情况，对患者身体正常发育的影响极为严重[5]。现阶段，临床治疗脊柱结核的方案主要有充足睡眠、卧床休息、营养支持等支持疗法、抗结核药物治疗、手术治疗以及康复治疗[6-8]。因脊柱结核导致的椎体破坏单纯应用药物治疗是无法完全修复的，而患者行结核病灶清除术治疗后会出现结核性骨缺损，需进行植骨填补，否则会导致椎体塌陷，但人工骨移植又会产生诸多并发症，对此组织工程学修复成为了治疗脊柱结核的潜在方案之一[9-11]。miRNA 是一种参与转录后进行调控的微小RNA，广泛存在于生物体中，miRNA 与靶基因miRNA 碱基进行配对，进而致使靶基因miRNA 碱基降解或翻译受阻，最终发挥出真正的调控作用[12-14]。骨髓间充质干细胞具有自我更新及多向分化的潜在能力，有研究已经证实，骨髓间充质干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等诸多细胞株，也是主要的成骨进行自我修复的种子细胞来源[15]。

该次研究结果显示，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化期间筛选出差异表达miRNA9，其中，miR-130b、miR-193b 为表达上调miRNA，miR-135、miR-424 为表达下调miRNA。于原样本中实施实时荧光定量PCR 验证，验证结果同基因芯片筛选结果存在高度一致性（Kappa=0.913，P＜0.05）。这与刘军政等[16]学者的结论一致，在其研究中得出，给予实时荧光定量PCR 验证同基因芯片筛选结果存在一致性（Kappa=0.876，P＜0.05）。骨髓间充质干细胞属于一类具备自我更新能力和多向分化的干细胞，当前多项研究也已经证实了miRNA 会参与到骨髓间充质干细胞多向分化的调节中，但miRNA 具体的调节作用属于一种非常复杂的调节网络，目前的研究还处在初级阶段[9-10]。

综上所述，高表达的miR-130b、miR-193b 及低表达的miR-135、miR-424 均能有可能调控骨髓间充质干细胞对成骨细胞的诱导分化过程。但由于骨髓间充质干细胞的诱导方式及来源有所差异，致使既往各研究结果所报道的miRNA 种类存在一定差异，因此，确切地参与调控骨髓间充质干细胞向成骨分化的miRNA尚需深入研究证实。