骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

李强强，谢亚东，杨国清 ，梁文强，张怀斌，王勇平

(1.兰州大学第一临床医学院，兰州 730030； 2.兰州大学第一医院骨科，兰州 730030)

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞构成，其中贴壁的基质细胞包含多能间充质干细胞、分化的骨髓间充质基质细胞。间充质干细胞主要依赖增殖分化完成自我更新，其具有多向分化潜能[1-2]，在特定诱导条件下，可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞分化[3]。如何定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化非常重要，其可为骨折修复、骨组织工程、骨质疏松等提供治疗方法。骨缺损、骨损伤属于骨科常见疾病，通常需要植骨治疗。植骨治疗包括异体骨移植修复和自体骨移植修复，其中自体骨移植疗效较好，不存在免疫反应，但自体骨供应受到一定限制；同种异体骨移植修复的缺点为移植骨存在免疫原性和致病性，最终导致骨损伤修复难以获得满意效果。研究发现，骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，可选择一系列诱导方式促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[4]。骨髓间充质干细胞可分化成多类组织细胞，且细胞免疫原性较弱，极易转染外源基因，成为组织工程研究的热点，同时其也在基因与细胞治疗领域展现出广阔的应用前景。鉴于骨髓间充质干细胞存在以上诸多优点，其有望成为骨缺损修复的理想种子细胞。现就骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展进行综述，以期为后续研究提供理论基础。

1 骨髓间充质干细胞

20世纪60年代有学者发现，骨髓中不仅有造血干细胞，还包含非造血系统多向分化的干细胞[5-6]。随着学者对骨髓基质进一步研究发现，骨髓基质细胞系统可随着造血干细胞系统一同成长，并能够完成自我更新，在一定条件下可分化为成骨细胞、网状细胞、成纤维细胞或脂肪细胞等间充质组织细胞群，因此将这类贴壁生长的骨髓单核细胞称作骨髓基质干细胞[7]。另有研究显示，骨髓间充质干细胞主要来源于间质系统的多能干细胞，其与造血干细胞共同分布在骨髓内，并保证骨髓的动态稳定[8]。骨髓间充质干细胞作为骨髓中常见的非造血干细胞，在体内外均可达到支撑与调控造血的目的[9]。有学者指出，若骨髓间充质干细胞缺失或功能受损，机体发生骨关节炎性疾病的风险增高[10]，其原因可能为：①骨髓间充质干细胞的数量、活力可随着年龄增长而不断减少和降低；②骨髓间充质干细胞丧失对周边调节信号的反应能力；③骨髓间充质干细胞的微生态环境受到影响，从而引发功能失衡；④免疫调节能力异常；⑤分化功能衰退等。骨髓间充质干细胞来源广泛，最初在骨髓内发现，随后在脐带血、脂肪组织、胚胎组织、外周血以及肝脏内也发现骨髓间充质干细胞的存在。

2 骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

2.1骨髓间充质干细胞的分离培养 骨髓间充质干细胞具有取材方便、体外培养增殖能力较强、极易定向分化为成骨细胞等优势，特别是自体骨髓间充质干细胞，其可抑制T细胞增殖，具有预防免疫应答、降低免疫原性的作用，是目前临床较为理想的骨种子细胞。虽然骨髓间充质干细胞取材较为简便，但在骨髓中含量较低。研究显示，骨髓间充质干细胞仅占骨髓单个核细胞的0.000 1%～0.01%[11]，因而难以满足组织工程种子细胞的需求，往往需要通过体外分离纯化才能达到大量扩增的效果。

目前骨髓间充质干细胞的分离方式较多，有流式细胞术分选法、免疫磁珠法、密度梯度离心法、全骨髓贴壁法等，其中流式细胞术分选法和免疫磁珠法可通过荧光、磁珠标记骨髓间充质干细胞表面抗原，具备操作简便、分选快速、精确度高等优势，但在分选期间可能导致细胞受损或死亡，加上仪器设备较为昂贵，操作期间需要的细胞数量较多，因此在临床的应用受到限制[12]。密度梯度离心法虽然操作简便，但极易导致原始骨髓间充质干细胞微环境受损，因此难以形成骨髓间充质干细胞集落。全骨髓贴壁法对细胞的伤害较小，且细胞增殖速度较快，经过培养可获得具有较高活性和纯度的骨髓间充质干细胞，故成为临床较为常见且简单便捷的体外培养方式之一[13-14]。

2.2骨髓间充质干细胞的鉴定 鉴定骨髓间充质干细胞的方法较多，但尚未统一，目前多采用免疫荧光染色法、流式细胞术，同时也可选择倒置显微镜观察细胞的形态变化，从而达到辅助鉴别骨髓间充质干细胞的目的。骨髓间充质干细胞存在多种表面抗原，但缺少特异性表面标志物。由于骨髓内包含造血干细胞、骨髓间充质干细胞，而骨髓间充质干细胞通常仅表达CD44、CD73、CD90、CD105等表面标志物，不表达造血细胞的表面标志物CD14、CD45、CD19、CD34及白细胞相关抗原[15-17]。因此利用流式细胞术给予荧光标记的单克隆抗体进行细胞分选，有助于与造血干细胞区分[18-19]。另外还可根据骨髓间充质干细胞的多向分化潜能进行间接鉴定，在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等分化[3]。综上，可将细胞形态、表面标志物、多向分化能力三者结合鉴定骨髓间充质干细胞。

3 骨髓间充质干细胞成骨分化的影响因素

随着研究的不断深入，骨髓间充质干细胞体外分离纯化、培养扩增与鉴定技术均取得了较大的进展，骨髓间充质干细胞成骨诱导分化主要依靠成骨诱导培养基，而成骨诱导培养基的组成成分包括地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠，三者存在剂量与时间相关性[20]。目前影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的因素较多，主要包括化学因素(成骨细胞培养基、枸橘苷、淫羊藿苷、骆驼蓬碱等)、生物因素(骨形态发生蛋白、前列腺素E2受体选择性激动剂等)、物理因素(电磁场、冲击波等)以及生物材料(纤维增强复合水凝胶纳米复合材料、多孔硅酸钙陶瓷材料、医用镁合金材料等)[21]。

3.1生物材料 近年来学者发现，生物材料在骨形态发生蛋白的表达中具有重要意义，同时还可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖分化[22]。有研究将锶元素置于多孔硅酸钙陶瓷材料离子提取物中与骨髓间充质干细胞进行复合培养发现，多孔硅酸钙陶瓷材料产生的硅、锶元素可明显提升骨髓间充质干细胞成骨基因、信使RNA的表达水平[23]。目前用于骨科植入的生物修复材料主要分为高分子材料和金属材料两大类，其中金属材料有不锈钢、钛合金、钴基合金、铁基合金等，但这些金属材料长期置入宿主体内易与周围组织发生电解质腐蚀，产生不良反应和局部炎症，造成生物相容性差，发生骨溶解[24]。以上缺陷无论发生哪一种，均可导致骨损伤修复效果不佳，甚至失败。高分子材料包括生物陶瓷和天然聚合物，由于它们在生物学性能及结构上与宿主机体结构存在一定差异，骨损伤修复效果不佳。因此，急需开发一种新型医用骨修复材料，以满足临床需求。

近年来，医用新型生物材料镁合金成为研究热点。研究显示，镁离子能促进骨细胞形成并加速骨组织愈合，且参与机体多种酶的活化、蛋白质合成、肌肉收缩等[25]。随着研究的深入发现，置入镁金属内植物与宿主不会发生明显的炎症反应，且能促进骨折断端骨痂形成，但纯镁材料腐蚀速率过快，无法达到人体支持骨折愈合需求，而镁金属合金的机械完整性和耐腐蚀性均优于纯镁[26]。镁合金是一种新型金属材料，其可作为心脑血管支架材料以及骨科植入材料[27]，目前关于镁合金对骨髓间充质干细胞生物学行为影响的相关报道较少。镁合金在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中具有重要意义，与其他生物金属材料相比，镁合金具有可降解性，与机体有较好的生物相容性，且具有骨整合、促进骨生成的作用。

镁具备一定降解性、生物相容性和力学性能，镁或镁合金作为骨科新型内植物材料，在骨再生的关键细胞骨髓间充质干细胞成骨分化中具有重要作用。研究发现，纯镁在机体中的降解速度较快，可直接降低治疗效果，加入铝、硅、钙或锰等金属元素后，可提升镁金属的耐降解性[28]，且不会增加不良反应，同时还可改善与机体内组织的相容性[29]。研究发现，镁合金表面具有一定黏附性能，随后对其细胞毒性进行探究发现，镁合金浸提液可能对骨髓间充质干细胞产生细胞毒性作用，但若能够进行微弧氧化表面改性，则可有效降低镁合金对骨髓间充质干细胞的毒性作用[30]。Lee等[31]对镁合金的生物学性能进行研究发现，镁合金材料均存在一定的细胞毒性，对其浸提液进行pH值调整发现，细胞增殖活性较好。在骨科可利用镁合金制备成界面螺钉置于机体中，利用镁合金的降解性与骨整合功效促进骨愈合，同时减少翻修手术的次数，降低对患者的伤害，为快速稳定病情提供保障[32]。体外实验证实，将镁合金置于骨髓间充质干细胞的培养基中进行培养，利用扫描电镜进行观察发现，镁合金表面有大量细胞依附，且生长状态较好，提示镁合金有助于骨髓间充质干细胞的黏附生长，进而诱导成骨样细胞的成骨分化，达到骨诱导目的[33]。研究发现，加入适量的镁合金浸提液可使成骨分化的标志物碱性磷酸酶的表达水平明显升高，而骨桥蛋白基因表达水平也呈现升高趋势[34]，但关于镁合金对成骨分化基因表达作用的影响还需进一步研究。

目前，镁合金作为内植物应用于骨科还有很多问题需要解决，其中最主要的问题为镁合金降解速率的不可控性。有效解决的方法包括：①表面涂层，如磷酸钙涂层和羟基磷灰石涂层，其应用广泛，涂层后镁合金降解速率控制效果显著；②改善镁合金成分，特定金属元素与镁合金化，金属元素通过结合反应提升材料的强度、耐腐蚀能力以及降低合金材料降解速率。但上述研究均处于实验阶段，镁及镁合金作为适宜的骨内固定物材料需满足一定的力学强度要求，且降解过程可控并允许骨长入，利于骨折愈合，故未来还需深入研究。

3.2其他 近年随着中医技术的迅猛发展发现，部分中药成分能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同时有助于修复骨缺损。报道显示，淫羊藿苷+成骨诱导培养基能够共同促进成骨细胞增殖分化[35]；补骨脂素+成骨诱导培养基可通过调节骨钙素、Runt相关转录因子2蛋白的表达，进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化[36]。富血小板血浆可有效促进骨髓间充质干细胞的增殖分化。研究显示，在骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基中加入富血小板血浆可促进骨髓间充质干细胞增殖，且诱导成功的成骨细胞碱性磷酸酶染色强阳性，成骨分化相关蛋白(如骨桥蛋白)信使RNA表达增加[37]。此外，激素在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖分化中也具有较重要的作用，研究发现，向成骨诱导培养基中加入17β-雌二醇，成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达水平明显升高[38]。

4 成骨细胞的鉴定

目前对于骨髓间充质干细胞经诱导后分化形成的成骨细胞主要依据成骨细胞的特征鉴定，如分泌Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶以及是否形成矿化结节等。其中对于碱性磷酸酶，可利用改良钙钴法染色鉴定。研究显示，骨髓间充质干细胞经诱导后碱性磷酸酶可出现明显升高的现象，使用改良钙钴法染色后矿化位置可见棕黑色或黑色沉淀或结节[39]。在动物实验中，大鼠骨髓间充质干细胞的表型免疫细胞经过化学染色后，其第三代骨髓间充质干细胞成骨标志物CD54、CD44及纤连蛋白抗原抗体反应呈阳性，而阳性反应物呈棕色或棕褐色，广泛分布在胞质内，尤其是胞核周边，提示骨髓间充质干细胞具有成骨分化的潜能[40]。骨髓间充质干细胞成骨诱导培养14 d后，学者采用免疫组织化学测定成骨标志物——骨连接素、骨桥素的表达发现，细胞核呈淡蓝色，胞质中存在较多棕黄色颗粒，提示成骨诱导分化成功[41]。骨髓间充质干细胞在成骨诱导体系作用2周后，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色后显示阳性反应，细胞质显示棕褐色，而Ⅲ型胶原免疫组织化学染色显示阴性反应，说明骨髓间充质干细胞成骨分化后主要分泌Ⅰ型胶原蛋白[42]。骨钙素又称为γ-羟基谷氨酸蛋白，常被作为成熟的成骨细胞合成维生素K依赖酶修饰的骨非胶原蛋白，在成骨细胞表型发育期间，骨钙素的表达显示发育阶段特异性，故其仅在基质矿化期开始后表达。

5 结 语

骨髓间充质干细胞可用于组织工程、干细胞移植、骨缺损修复、骨质疏松症以及骨折不愈合等，具有较大价值。骨髓间充质干细胞来源较少且缺乏分离纯化方法，目前亟须建立一种体外分离纯化方式，以达到大量扩增骨髓间充质干细胞的目的。促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方式较多，如何选择一种稳定并可在临床推广使用的方式还需进一步研究；利用生物材料复合骨髓间充质干细胞作为骨填充材料治疗骨缺损的研究取得了一定进展，但是由于生物材料存在降解速率过快、生物学性能不稳定、骨组织不匹配、不能建立有效的连接血供等缺陷，仍需多方面深入研究。