胚胎发育潜能的评估方法及应用价值

王芳，李红义，胡春秀

(武装警察部队特色医学中心军人生殖医学科，天津 300162)

全球约15%的育龄夫妇受到不孕症困扰[1]，而中国约有13.6%的新婚育龄夫妇婚后1年不孕[2]。辅助生殖技术广泛应用于不孕症的治疗，但多胎妊娠率高达30%以上[3]，较高的多胎妊娠率增加了患者的心理负担和家庭、医院、社会的经济成本[4]。目前，解决高多胎妊娠率、实现高单胎活产率的最佳方案是选取最具发育潜能的单个优质胚胎进行移植，从而达到优生的目的[5]。形态学评分是评估卵子和胚胎发育潜能最常用的方法，但其具有单一时间点观察、主观因素影响大、对着床结局的预测不准确等缺点[6]。延时摄像技术可连续观察胚胎的成长过程，当结合计算机的分析功能时，可为未来自动筛选胚胎提供可能[7]。胚胎植入前遗传学检测(pre-implantation genetic testing，PGT)技术，尤其是针对非整倍体的遗传学检测，可为降低流产率、提高妊娠率以及有效阻断致病基因的垂直传播提供参考[8]。非侵入性的代谢组学评估能反映细胞的功能是否正常，为筛选潜能胚胎提供新的“窗口”[9]。以上方法对胚胎发育潜能的评估各有优点，现就其进展情况予以综述。

1 基于形态学的胚胎评估方法

1.1传统形态学评估和囊胚培养技术 目前，国内外胚胎实验室仍广泛采用传统的形态学评分预测胚胎发育潜能。在每天特定的时间对胚胎进行形态学观察，原核数目和形态、卵裂球数目、碎片程度及卵裂球大小的均一性等被作为评估胚胎发育潜能是否良好的指标[6]。此外，胚胎胞质中的空泡、粗颗粒区域聚集、滑面内质网聚集、每个卵裂球中出现的多核等现象也引起了胚胎学家的重视，但其对妊娠结局的影响仍不明确，是否可作为胚胎发育潜能评估的补充指标仍有待进一步研究。

随着胚胎培养技术日益成熟，胚胎培养成囊胚再行移植成为胚胎实验室的常规操作。事实上，囊胚培养本身也可对胚胎发育潜能进行评估，在培养至第3天时，胚胎基因组被部分激活，发育潜能较好的胚胎可继续发育成囊胚，较差的则发生退化，即完成了胚胎的自我筛选[10-11]。随机对照研究显示，经过囊胚的再次筛选，患者可获得更好的妊娠结局[12-13]。与卵裂期胚胎移植相比，新鲜移植周期和解冻移植周期的囊胚移植均有更高的临床妊娠率和活产率[12]；且在全胚冷冻周期中，解冻囊胚首次移植的活产率也显著高于卵裂期胚胎[13]，因此囊胚移植被广泛应用于临床实践。

然而，学者针对囊胚移植的研究仍有不同结论。Martins等[10]研究显示，囊胚移植和卵裂期胚胎移植的活产率、临床妊娠率和累积妊娠率比较差异均无统计学意义。亦有研究显示，囊胚移植与早产、低出生体重儿和小胎龄儿的风险增加有关[14]，且其围生儿死亡率和新生儿并发症发生率均高于卵裂期胚胎移植[15]。美国生殖医学学会提出囊胚培养技术可能与单卵双生和新生儿的不良结局发生率的小幅增加有关[16]。以上研究提示，囊胚移植可能与围生期及新生儿的不良结局有关。因此，需要更多加强囊胚移植患者的孕后管理和监测。

综上所述，囊胚移植可获得更高的植入率，其中单囊胚移植可减少胚胎移植数量，降低多胎妊娠率。然而，囊胚移植也具有一定的风险，如无胚胎移植、新生儿不良结局等，且囊胚移植并不能避免由染色体异常引发的流产问题等。因此，是否进行囊胚移植仍需综合临床多种因素考虑。

1.2延时摄像技术 传统的形态学评估会使胚胎暴露在不稳定的温度和pH值条件下，对胚胎存在潜在的有害影响，且仅限于在每天的特定时间进行一次评分，可能会忽略胚胎动态发育中的某些关键阶段[9]。为更清晰地了解胚胎发育的全过程，延时摄像技术应运而生，其在2009年应用于临床，可在稳定培养条件下，连续、定时地监测卵子及胚胎的成长过程，获取丰富的视频数据，为全面评估胚胎的发育潜能提供了新方法，也为胚胎筛选提供了更多、更细致的研究数据[17]。

一项多中心研究表明，应用延时摄像技术筛选胚胎可使临床妊娠率增加约20%[18]，表明延时摄像技术可以提高胚胎筛选的成功率，改善临床结局。此外，延时摄像技术与其他技术结合具有更好的胚胎筛选效果，如Rocafort等[19]研究显示，延时摄像技术与PGT结合是筛选最佳植入潜能的整倍体胚胎的有效方法。但延时摄像技术也存在一些问题，其形态动力学参数的定义注释并不精确，可造成不同操作者因对参数的理解差异而产生结果误差[20]。有研究者引入计算机深度学习模型，利用延时摄像技术获取大量视频数据，建立学习模型进行信息组合分析，形成严格的胚胎评估分级，提升胚胎筛选的自动化和标准化[21]。

然而，有学者对延时摄像技术的使用持有不同见解。Faramarzi等[22]研究显示，使用延时摄像技术对卵子的形态动力学参数(包括卵胞质形态、透明带宽度、卵周隙大小、第一极体形态)及胚胎形态动力学参数(包括第二极体排出时间、原核形态、原核消失时间、2～8个细胞的形成时间及卵裂发生的时间)进行综合评估筛选胚胎后，无法有效改善二代试管婴儿的胚胎发育结局。此外，延时摄像技术对胚胎进行高频率的曝光拍照时，其所用的短波光对胚胎的影响以及使用该技术的长期安全性也有待进一步研究论证。

可见，延时摄像技术可提供新的胚胎观察模式，实现在稳定环境中对胚胎的实时观测，显示传统观察无法显示或忽视的细节，提供对胚胎活力评估有重要意义的动态参数，如Coticchio等[20]利用延时摄像技术研究受精事件的形态动力学参数，结果显示，胞质晕消失与原核破裂的时间间隔可以预测卵裂球数目及碎片情况，且此项技术与其他技术结合运用，可为未来胚胎潜能评估和筛选提供新的方向。但对延时摄像技术的安全性以及尽快建立关于延时摄像技术的有效胚胎评估体系，需进一步的探索和研究。

2 PGT

PGT是在胚胎移植前筛查胚胎染色体，以排除携带遗传疾病及染色体异常胚胎的检测方法。随着辅助生殖技术的进步，PGT可利用胚胎卵裂球、囊胚滋养层细胞及胚胎培养基中的无细胞DNA等评估和筛选胚胎，为基因或染色体异常患者带来希望[8]。PGT可通过多种技术手段实现，包括荧光原位杂交法技术、基因组杂交微阵列技术、实时荧光定量聚合酶链反应技术、高通量测序技术等。目前，PGT已用于鉴定200多种遗传性疾病，其适应证包括常染色体隐性疾病、常染色体显性疾病、性染色体连锁疾病、具有重要延迟发育的遗传突变、染色体结构异常、染色体数目异常、线粒体疾病以及医学原因进行的性别选择[23]。其中非整倍体植入前基因检测(pre-implantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)技术应用最为广泛，主要适用于高龄妇女、不明原因复发性流产及反复胚胎种植失败患者的胚胎筛选[24]。

2.1侵入性的PGT-A 对从卵子、受精卵中移除的极体或胚胎细胞(包括卵裂球细胞、囊胚滋养层细胞)进行活检是目前评价胚胎染色体的整倍体性较为可靠的方法。由于极体活检存在无法提供父系遗传信息的缺陷，卵裂球细胞活检仅能获取极少量遗传物质(1～2个细胞)，常导致基因扩增失败及卵裂球活检损伤胚胎活力等问题，因此临床较多使用侵入性的PGT-A进行基因检测，其优势在于能采集更多的细胞(5～10个)进行DNA分析，避免卵裂期活检对胚胎继续生长发育的影响，且可在囊胚阶段淘汰部分非整倍体胚胎，使检测结果更为准确[25]。目前，侵入性的PGT-A较常采用的检测方式为利用囊胚滋养层细胞进行基因组DNA提取与扩增，再通过高通量测序技术进行分析。一项随机对照研究显示，单个整倍体胚胎移植可显著提高活产率，降低流产率和多胎妊娠率[26]；在高龄(40～43岁)女性患者中移植整倍体胚胎，也可获得较高的种植率和活产率[27]。可见，经过PGT-A筛选后的整倍体胚胎，移植后能获得更优良的临床妊娠结局。

但PGT-A也存在以下问题亟待解决：①嵌合体现象对结果准确性的影响。嵌合体是在两个及以上基因上存在不同细胞谱系的现象，约32%的人类胚胎存在嵌合体，且整倍体/非整倍体嵌合的发生率可高达17%[28]。由于囊胚活检仅使用较少的滋胚层细胞，不能囊括全部的染色体位点，因此其检测结果无法反映最终形成胎儿的内细胞团的基因组特征，极大可能会出现误检或漏检的情况。误检导致丢弃大量正常胚胎，有研究显示丢弃正常胚胎的比例可高达40%[29]。有文献报道，移植PGT-A为异常的胚胎后，患者生出健康胎儿[30]，提示存在误检的可能性。相反，移植漏检胚胎可能会导致不孕或畸形胎儿的出生，造成患者巨大的物质和精神损失。②活检操作技术的差异性可导致PGT-A结果的不确定性。囊胚活检需要经过专业培训的人员通过专门的设备执行操作，以保护胚胎的生存能力，操作人员的技术差异可直接影响结果的准确性[31]。③目前仍没有关于囊胚活检安全性的长期数据，如活检操作是否会导致印迹基因紊乱等，因此侵入性PGT-A技术的安全性仍需进一步研究。

虽然基于卵裂球和滋养层细胞活检的PGT可实现健康孕育的目的，但上述困难仍未得到很好解决。因此，PGT的发展取决于其诊断的准确性和安全性。随着分子生物学诊断方法的不断发展及人类基因组遗传信息的不断完善，PGT可能会克服现有的难题，带来临床获益。

2.2非侵入性PGT-A(non-invasive pre-implantation genetic testing for aneuploidy，niPGT-A) 理想的胚胎评估方法是无创、非侵入性的，不影响胚胎正常培养，不直接造成胚胎损伤。niPGT-A是一种非侵入性检测技术，用于分析废弃的胚胎培养基和囊胚腔中微量的游离DNA，从而获取染色体拷贝数信息[32]。该技术的优势是可利用细胞游离DNA，游离DNA易于获取，且此方式对胚胎损伤的风险较低。研究显示，在胚胎培养第3天和第5～7天均能检测到游离DNA，且随着时间的推移，培养基中的游离DNA逐渐增多，niPGT-A的结果也更加准确[33]。此外，Huang等[34]研究证实，胚胎培养基中游离的DNA能反映囊胚滋养层和内细胞团的倍性信息；该研究结果还显示，在去除所有卵冠丘复合物后，niPGT-A的假阴性率为0%；当选择合适的嵌合体阈值后，niPGT-A的阳性预测值和特异度均远高于囊胚滋养层活检的PGT-A，表明niPGT-A结果更为可靠。

然而，有研究表明对胚胎培养基进行niPGT-A所获得的胚胎染色体倍性一致率远低于对滋养层细胞进行PGT-A[35]，这可能由于胚胎培养基中的游离DNA水平低于滋养层细胞样本，造成扩增效率较低。但目前相关临床研究较少，尚不能判断胚胎培养基的niPGT-A是否能带来临床获益。

囊胚腔液样本的niPGT-A是建立在囊胚腔穿刺的基础上，虽具有一定的侵入性，但对胚胎的整体损伤较小，具有较好的临床应用前景。Magli等[36]对256例囊胚腔液样本采用全基因测序和微阵列比较基因组杂交技术，结果显示，71%的囊胚腔液样本成功扩增，其中87%提供了有信息的染色体拷贝数结果，倍性一致率为93.6%，证实利用囊胚腔液DNA能获得较准确的细胞遗传学评估。同时，该研究也证实了囊胚腔液游离DNA作为PGT-A扩增模板的可行性。然而，来自12对夫妇共23例囊胚腔穿刺样本和囊胚滋养层活检样本的研究显示，仅有34.8%的囊胚腔液样本成功实现全基因组测序；且在获得染色体拷贝数数据的9例样本中，只有37.5%的样本显示与对应的滋养层活检完全一致的核型[37]，此数据仍未达到临床应用的要求。

无论是对胚胎培养基样本还是囊胚腔液样本，niPGT-A主要存在两个共性问题：①如何稳定且准确地从胚胎培养基或囊胚腔液中获得适合遗传分析的足量DNA模板；②仍需进一步研究胚胎DNA释放的机制，以确定从囊胚腔液和胚胎培养基中获得的DNA能真实反映相应胚胎的遗传学特征。若能解决以上问题，niPGT将成为一种更简单、安全、可靠的PGT方法；且成本更低，临床获益较大。

3 代谢组学

代谢组学是继基因组学后被认为有效、非侵入性、可用于评估胚胎活力的生物学指标，是对生物细胞、组织或器官等样本中的低分子量代谢产物进行定性和定量分析的学科[38]。由于代谢组学可提供关于细胞内代谢的有效信息，且检测种类少，检测时间短，因此引起研究者的广泛关注。作为“细胞功能的信息提供者”，代谢组学研究可呈现细胞对外界环境的反应，体现细胞、组织或有机体的功能表型，从而揭示细胞的实际功能状态，获得较基因组学、转录组学或蛋白组学更多潜在的直接信息[9]。但目前代谢组学分析在胚胎发育潜能评估中的应用尚处于起步阶段，物质代谢图谱与妊娠结局的相关性仍有待深入研究。

3.1代谢组学分析技术 代谢组学常用的分析方法有4种，即核磁共振技术、液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术和近红外光谱分析技术。核磁共振技术能够实现对样品的无偏向性、无创性检测分析，但其价格较为昂贵，且使用光谱分析技术检测丰度较低的化合物较为困难[39]，故其在临床应用受限。Kirkegaard等[40]研究显示，用核磁共振技术分析第3天和第5天的胚胎培养基，不能预测预后良好患者的妊娠结局，这可能由于胚胎培养基中的代谢物浓度过低，核磁共振技术无法进行有效检测。

基于色谱技术的两种方法各有优点。液相色谱-质谱联用技术具有较强的鉴定能力，分析快速方便，可同时检测大分子量化合物和热不稳定化合物等，但缺点在于无商品化图谱作为参照物，只能自行建库[41]。气相色谱-质谱联用技术具有较为成熟的商品化水平，主要用于小分子易挥发的化合物，且灵敏度高、重复性好，但其检测样品必须能够气化，无法对热不稳定和难挥发物质进行分析[42]。

近红外光谱分析技术主要基于近红外光谱中丰富的羟基和氢键信息，变化的光谱可以反映物质结构的改变或水与溶质之间的相互作用，在分子层面获取丰富的信息[43]。有研究使用近红外光谱法测定新鲜或解冻胚胎培养基的代谢谱，结果显示，胚胎生存指数单独使用或与形态学评分结合使用，较单独的形态学评分对胚胎植入结局的预测更加客观可靠[44]。但另一项研究显示，应用近红外光谱法进行的代谢组学分析存在组内变异，会导致假阳性和假阴性的发生[45]，因此需谨慎使用。

随着科技的不断进步，将涌现出更有潜力的代谢组学分析技术，如拉曼光谱技术，但新技术仍在不断的摸索和尝试中，其成熟应用于临床仍需大量的数据积累和支持。

3.2代谢组学分析成分 代谢组学研究是对胚胎培养液、囊胚腔液及女性生殖道各种生物液体(卵泡液、子宫内膜液等)中存在的小分子、非蛋白质类化合物进行系统的分析，确定、量化与正常及病理状态相关的代谢物，从而预测胚胎发育潜能。目前主要检测物质包括葡萄糖、丙酮酸、氨基酸以及部分细胞因子(可溶性人白细胞抗原、胰岛素样生长因子等)。

胚胎在早期以丙酮酸和乳酸代谢为主要代谢底物，囊胚期以葡萄糖为主要代谢底物，因此，丙酮酸和葡萄糖的代谢水平常被用作胚胎发育潜能评估指标之一。宋蕊等[46]研究显示，在培养第3天，对葡萄糖利用度高的胚胎可促进囊胚形成，提示胚胎具有更高的发育潜能，但在培养第3天和第5天时，胚胎对丙酮酸的利用程度与囊胚形成无关。李晨阳[38]研究显示，在胚胎发育第3天，与劣质胚胎组相比，优质胚胎组存在包括L-谷氨酰胺在内的10个显著性差异的代谢物。可溶性人白细胞抗原同样可作为胚胎发育潜能评估指标之一，研究显示，当人类胚胎培养液中缺乏可溶性人白细胞抗原时，可导致胚胎发育异常和妊娠率降低；当培养液中可溶性人白细胞抗原处于高表达水平时，胚胎的临床妊娠率和种植率更高[47]。体外培养胚胎时，胚胎分泌至培养液中的胰岛素样生长因子可促进囊胚摄取葡萄糖，进而促进胚胎生长发育，故培养液中的胰岛素样生长因子水平可作为评估胚胎发育潜能的指标之一[48]。

由于代谢组学发展时间较短，多数实验仅为单中心研究，检测条件及方法无法标准化，尚不能确定胚胎发育潜能评估的特异性生物标志物。一项对随机对照研究结果的荟萃分析显示，仍缺乏足够的证据证实代谢组学评估能够有效改善临床妊娠率和活产率[49]。因此，代谢组学在胚胎发育潜能评估中的作用仍有待进一步研究。

4 小 结

胚胎发育潜能评估仍是体外受精技术中的一个关键问题。形态学评分是目前应用最广的评估方法，虽成熟、有效，但标准不统一，很难避免主观性，且单一时间点观察对着床结局的预测并不完全准确；囊胚培养进行胚胎再次筛选，单囊胚移植可较为有效地预防多胎妊娠，但仍不能避免将异常基因遗传给子代。延时摄像技术提供了稳定可控的实时胚胎观察模式，PGT可从基因组学反映胚胎染色体及DNA状态，其技术方法也正朝着无创检测的方向发展。代谢组学检测可提供胚胎细胞的生物功能状况，展现出强大的潜在应用价值，为建立更准确的胚胎评估体系打下基础。此类筛选方法从胚胎的形态、基因、代谢等多个层面入手，可更准确地评价胚胎发育潜能，但仍存在局限性，未来需更多大样本数据支持。