熊去氧胆酸促进肝癌HepG2细胞凋亡研究

彭 娇，林久茂，2，3，严月华，王雪皎，林明和，张金凤，赵锦燕，2，3*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.中西医结合基础福建省高校重点实验室，福建 福州 350122；4.复旦大学附属浦东医院，上海 200120）

中医药低毒、高效、多靶点的优势在肿瘤治疗中的作用越来越受到国内外学者的关注，尤其是许多中草药提取物或有效成分均已证实有抗肿瘤功效。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是名贵中药熊胆粉的主要成分，是治疗原发性胆汁性肝硬化的一线用药，研究证实UDCA 具有保护肝细胞作用［1-2］。同时也有研究发现UDCA 具有抗肝癌的作用，且在一定剂量范围内对正常细胞没有明显的细胞毒性［3］。UDCA 抗肝癌的作用及机制研究能够为临床肝癌用药提供依据，因此，本研究观察UD⁃CA 对肝癌HepG2 细胞（以下简称HepG2 细胞）凋亡的影响，探讨UDCA 治疗肝癌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 UDCA（大连美仑生物技术有限公司，批号：J0324AS，纯度＞98%）；胎牛血清（批号：2282182P）、胰酶（批号：2323527）和RPMI-1640 培养液（批号：8122243）均购自美国Life 公司；二苯基四氮唑溴盐（MTT，德国BIOFROXX 公司，批号：E24567C114）；HepG2 细胞（南京凯基生物技术有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0220-Nov-19G）；JC-1 线粒体膜电位荧光探针（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20210119）；Bcl-2 抗体（美国Protein Tech 公司，批号：00093692）。

1.2 实验方法

1.2.1 UDCA 药液的制备 UDCA 经超纯水溶解后制备成1 mmol/L 母液，储存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 HepG2 细胞培养 HepG2 细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基中，置37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞汇合度约80%～90%时，用0.25%胰酶消化、传代培养。收集对数生长期HepG2细胞，分为0 μmol/L 组（对照组）和5 μmol/L 组、10 μmol/L 组（药物组）。

1.2.3 MTT 法检测细胞活力 取各组细胞，按照1×104个/孔细胞接种于96 孔板中，每组设8 个复孔；用0、5、10 μmol/L UDCA 药液干预24 h，吸弃培养基，加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，置37 ℃培养箱中继续孵育4 h；吸弃上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO），于全自动酶标仪570 nm 处检测每孔吸光度值（A 值），并计算细胞增殖抑制率。

1.2.4 细胞数量、形态观察 取各组细胞，按照2×105个/mL 细胞接种于6 孔板中，分别用0、5、10 μmol/L UDCA 药液干预24 h，干预后在倒置光学显微镜下观察细胞数量、形态。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 取各组细胞，以2×105个/mL接种于6孔板，置37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养过夜；分别用0、5、10 μmol/L UDCA干预24 h 后，0.25%胰酶（不含EDTA）消化，收集细胞，以1 000 r/min离心5 min，重悬制备单细胞悬液；用1×binding buffer 调整细胞数为1×106个/mL，取100 μL 细胞至5 mL 流式管中，每管加5 μL FITC AnnexinⅤ和5 μL 碘化丙锭溶液（PI），充分混匀后于室温（25 ℃）避光孵育15 min；然后每管加400 μL 1×binding buffer，1 h 内于流式细胞仪（FL1 和FL2通道）检测。流式细胞仪检测结果：左下象限为正常细胞百分比，右下象限是早期凋亡细胞百分比，右上象限是晚期凋亡细胞百分比，左上象限是细胞碎片百分比。

1.2.6 JC-1 染色法检测细胞线粒体下降的体膜电位 取各组细胞，分别用0、5、10 μmol/L UDCA 干预HepG2 细胞24 h 后，收集细胞，以1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入JC-1 染色液500 μL（终浓度10 μg/mL）重悬细胞，于37 ℃避光孵育30 min；以1 000 r/min 离心5 min，弃上清，PBS 反复洗细胞2 次，加入500 μL PBS 重悬细胞，用流式细胞仪检测线粒体下降的膜电位。仪器参数：激发波长为488 nm，检测发射波长为590 nm（红光）和525 nm（绿光）。正常细胞线粒体膜电位用FL2 通道检测，下降的线粒体膜电位用FL1 通道检测，用绿色荧光与红色荧光的比值来表示。

1.2.7 RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA相对表达量 取各组细胞，分别用0、5、10 μmol/L UDCA 干预HepG2细胞24 h 后，Trizol 法提取HepG2 细胞总RNA，根据逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到cDNA；以管家基因GAPDH 为对照，引物序列利用Primer 5.0 软件进行设计，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果用Bio-Rad 凝胶成像分析系统进行电泳条带分析，引物序列及扩增产物片段长度为：Bcl-2（268 bp）F：5′-GGTGGTGGAGGAACTCTTCA-3′；R：5′-GAG CAGCGTCTTCAGAGACA-3′。

1.2.8 Western blot检测Bcl-2蛋白相对表达水平 取各组细胞，分别用0、5、10 μmol/L UDCA 干预HepG2细胞24 h 后，收集细胞，加入500 μL 含有PMSF 的裂解液裂解细胞，以10 000 r/min 高速离心10 min，收集上清后采用BCA 法进行蛋白定量。各组样本取30 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，条件：浓缩胶电压80 V，分离胶电压100 V。电泳完成后进行转膜：100 V 条件下45 min将蛋白转移至PVDF膜上。常温封闭120 min后，一抗4 ℃孵育过夜。然后将PVDF膜用TBS-T 漂洗3 次×10 min，常温二抗孵育1 h，再次用TBS-T 漂洗3 次×10 min。使用BeyoECL Plus 化学发光试剂处理PVDF 膜，于化学发光成像系统ChemiDocXRS+下成像。用Image Lab 软件对蛋白灰度值进行数据分析，以Bcl-2 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值得出Bcl-2 蛋白相对表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。计量资料服从正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 3 组细胞增殖抑制率比较 与0 μmol/L 组比较，5 μmol/L 组和10 μmol/L 组UDCA 对HepG2 细胞增殖抑制率均显著升高（P均＜0.05），且UDCA药物浓度越高抑制率越强。见表1。

表1 3 组细胞增殖抑制率比较（±s）

表1 3 组细胞增殖抑制率比较（±s）

注：与0 μmol/L 组比较，1）P＜0.05。

组别0 μmol/L组5 μmol/L组10 μmol/L组n8 8 8细胞增殖抑制率/%0 44.8±0.031）61.2±0.021）

2.2 3 组细胞数量、形态比较 倒置光学显微镜下观察细胞形态发现：0 μmol/L 组HepG2 细胞贴壁牢固，细胞边界清晰，密度较大，悬浮细胞较少；5 μmol/L 组和10 μmol/L 组细胞密度显著减少，细胞脱落变圆，悬浮细胞相对增加。这说明UDCA 可抑制肝癌细胞生长，促进HepG2细胞死亡。见图1。

图1 3 组细胞数量、形态比较（×200）

2.3 3 组细胞凋亡率比较 5 μmol/L组和10 μmol/L组细胞凋亡率分别是（32.67±4.16）%、（60.49±5.60）%，均 明 显 高 于0 μmol/L 组 细 胞 凋 亡 率（11.59±1.35）%，差异均具有统计学意义（P均＜0.05），且UDCA 药物浓度越高，细胞凋亡率越大。见图2。

图2 3 组细胞凋亡率比较

2.4 3 组线粒体下降的膜电位比较 5 μmol/L 组和10 μmol/L 组线粒体下降的膜电位分别为（29.64±4.16）和（60.49±5.60），均大于0 μmol/L 组线粒体下降的膜电位（18.71±1.35），差异均具有统计学意义（P均＜0.05），且UDCA 药物浓度越高，线粒体下降的膜电位越大。见图3。

图3 3 组线粒体下降的膜电位比较

2.5 3 组细胞Bcl-2 mRNA 相对表达量比较 与0 μmol/L 组比较，5 μmol/L 组和10 μmol/L 组细胞Bcl-2 mRNA 相对表达量均降低（P均＜0.05），且UDCA 药物浓度越高，细胞Bcl-2 mRNA 相对表达量下降越明显。见图4。

图4 3 组细胞Bcl-2 mRNA 相对表达量比较

2.6 3 组细胞Bcl-2 蛋白相对表达水平比较 与0 μmol/L 组比较，5 μmol/L 组和10 μmol/L 组细胞Bcl-2 蛋白相对表达水平均降低（P均＜0.05），且UDCA 药物浓度越高，细胞Bcl-2 蛋白相对表达水平下降越明显。见图5。

图5 3 组细胞Bcl-2 蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

我国因肝癌死亡人数约占全世界肝癌死亡人数45%，是病死率最高的肿瘤之一［4-5］。由于肝癌对放疗的敏感性差，而常规化疗药物（如阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂、α 干扰素等）均有其不同的适应证和毒副作用，也不能有效缓解症状或延长生命，因此，作为经济、有效、不良反应轻的中草药及其提取物的应用备受关注。

UDCA 是最早从黑熊胆汁中分离的胆汁酸，研究发现UDCA 能护肝细胞，对胆管炎、溃疡性结肠炎、胆汁淤积症和病毒性肝炎等均有疗效［6-9］。细胞凋亡异常是肿瘤发生的重要原因［10-12］。本研究结果显示UDCA 可促进HepG2 线粒体膜电位下降，促进肝癌细胞凋亡。Bcl-2 家族是与细胞凋亡密切相关的基因，其中Bcl-2 是最早发现的参与细胞凋亡的一种癌基因，在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用，其表达产物Bcl-2 蛋白具有抗凋亡作用［13-14］。本研究结果显示UDCA能下调Bcl-2 mRNA相对表达量和蛋白相对表达水平，证实UDCA 能抑制Bcl-2 表达，促进肝癌细胞凋亡，且药物浓度越高，UDCA 促进肝癌细胞凋亡作用越强。

综上所述，UDCA 能够抑制HepG2 细胞Bcl-2表达，通过诱导线粒体膜电位下降，促进细胞凋亡，这可能是其抑制HepG2 细胞生长的重要机制。