宏基因组二代测序与传统病原检测在中性粒细胞减少伴发热白血病患儿中的对比研究

康 磊 郭 芳 白新凤 徐梅先

河北省儿童医院1.重症监护科，2.感染科（河北石家庄 050031）

白血病是儿童最常见的恶性疾病，占所有儿童期恶性病的29.0%[1]，且在儿童中的患病率仍呈逐年上升趋势[2]。中性粒细胞减少伴发热（febrile neutropenic，FN）不仅是白血病患儿最常见的合症，还是其发生脓毒性休克和死亡的主要原因[3]。FN儿童常因传统病原检测（traditional pathogen detection，TPD）不能识别病原体而给予经验性抗感染治疗[4]，而经验用药容易导致抗生素滥用、诱发病原耐药，并增加抗微生物相关不良事件发生率。有研究表明，不适当的经验性治疗与死亡率增加有关[5]。因此，对于白血病化疗后骨髓抑制期的FN 儿童，早期识别病原并给予针对性抗感染，是降低其死亡风险的关键所在。

TPD 如培养法等，耗时长、阳性率低，而核酸扩增需使用特定的引物，不能很好地满足临床需求。相比之下，宏基因组二代测序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）耗时短、灵敏度高，对TPD 难以检出的病原菌微生物及多种病原混合感染更有优势[6-7]。最新的共识推荐将mNGS 用于严重感染性疾病，尤其是免疫受损的患者[8]。已有研究表明mNGS 在原发性免疫缺陷患者的病原诊断，尤其是条件致病菌和混合感染方面，具有明显优势[9]。但是，尚无mNGS 在白血病合并FN 患儿中的应用。本研究通过分析白血病儿童合并FN 的病原检测结果，对mNGS与TPD的应用价值进行对比研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2018年1 月1 日至2021年7 月1 日河北省儿童医院重症监护病房收治的白血病化疗后合并FN 患儿资料。纳入标准：①年龄＜18 岁；②经骨髓穿刺等确诊白血病，已接受化学治疗；③符合FN 标准，连续2次体温＞38.0 ℃且持续超过1 h，中性粒细胞计数＜500/mm3[10]；④初始抗感染治疗失败而转入PICU。排除标准：①原发性免疫缺陷；②除血流感染及肺部感染外其他部位感染者。

本研究获医院医学伦理委员会批准通过（No.2018013）。

所有研究对象在病原未明时按照指南建议[11]的方案进行抗感染治疗。白血病分为急性淋巴细胞性白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）组和急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）组。不同感染灶的常见致病原不尽相同，因此根据感染灶分成两组，A组（血流感染）和B组（肺部感染）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 包括性别，年龄，并发症包括脓毒症性休克、肺出血、急性呼吸窘迫综合征（ARDS），存活情况，序贯器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）评分，实验室检测结果包括中性粒细胞绝对计数（ANC）、C 反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT），mNGS延迟天数。

1.2.2 mNGS 送检标本均符合华大基因要求，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000 平台，对样本中微生物核酸序列进行分析，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，从而对微生物进行鉴定。检测过程包括：核酸提取、RNA 逆转录、文库构建、测序、信息分析、报告解读。

1.2.3 TPD ①培养与形态学：血液细菌、真菌培养，出现呼吸道症状的患儿同时留取肺泡灌洗液行细菌及真菌培养，并进行涂片、抗酸染色、墨汁染色；②血清学：肺炎支原体、衣原体、腺病毒、流感病毒血清抗体检测，流感病毒、腺病毒、博卡病毒、偏肺病毒和冠状病毒免疫荧光检测，G 试验、GM 试验；③聚合酶链反应（PCR）：采用多重PCR 扩增技术对肺泡灌洗液行肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）进行检测。

1.2.4 mNGS阳性病原结果判定 mNGS结果阳性，并符合下述条件之一，则认为是致病原。①mNGS 病原体结果与至少一种TPD 鉴定的结果一致，是导致FN 的原因。②mNGS 检验与TPD 结果不一致，根据临床，放射学或实验室的发现，mNGS 病原体结果是FN 常见致病原之一。③mNGS 检验结果与TPD 不一致，且不是常见的病原，基于病史、体格检查、非微生物检测（临床经验和文献报告等），mNGS结果与发生的严重感染表现相符，而且没有其他微生物感染的证据。④诊断性治疗有效，对mNGS检测的病原结果，采取针对性治疗有效，病情恢复后复测mNGS转阴。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。不符合正态分布的计量资料以中位数（M）和四分位数范围（P25～P75）表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确法检验。mNGS与传统病原检测结果的比较采用配对χ2检验（McNemar 检验），两种诊断结果的一致性采用Kappa检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

共有56例白血病化疗后合并FN 的患儿符合标准纳入研究，男27例、女29例，中位年龄4.0（2.0～7.8）岁。A 组39例，ALL 28例、AML 11例。B 组17例，ALL 10例、AML 7例。无论A 组，还是B 组，ALL和AML 之间年龄、性别、并发症发生率、存活率、SOFA 评分、ANC、CRP、PCT、mNGS 延迟天数的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。死亡病例11例，6例（54.5%）死于侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA），3例死于细菌感染引起的脓毒性休克，1例死于肺孢子菌引起的ARDS，1例死于肺出血。

2.2 病原检测结果

综合mNGS与TPD结果，A组患儿最常见的真菌为曲霉菌（n=15，38.5%）和念珠菌（n=12，30.8%），最常见的细菌为鲍曼不动杆菌（n=12，30.8%）和肺炎克雷伯菌（n=7，17.9%）。B 组患儿最常见的真菌同样为曲霉菌（n=7，41.2%）与念珠菌（n=4，23.5%），最常见的细菌为鲍曼不动杆菌（n=5，29.4%），其次为肺炎链球菌（n=3，17.6%）和屎肠球菌（n=3，17.6%）。此外A 组罹患ALL 的患儿病毒阳性率高，最常见的病毒为EBV。见表2。

2.3 mNGS与TPD诊断阳性率的比较

mNGS与TPD检测阳性率的一致性较差（Kappa=0.039）；经McNemar 检验发现，mNGS 检测阳性者（80.4%）明显高于TPD（58.9%），差异有统计学意义（P=0.023）。见表3。

表1 基线资料

表2 A组和B组病原检测结果[n (%)]

两种检测方法对常见病原的检测结果比较见表4。A 组mNGS 对曲霉菌（14/39，35.9%对5/39，12.8%）、念珠菌（11/39，28.2%对4/39，10.3%）和鲍曼不动杆菌（11/39，28.2%对3/39，7.7%）的检测阳性率均高于TPD，差异有统计学意义（P＜0.05）。B 组mNGS 对曲霉菌（8/17，47.1%对1/17，5.9%）的检测阳性率均高于TPD，差异有统计学意义（P＜0.05）。B 组mNGS 对鲍曼不动杆菌（2/17，11.8%对4/17，23.5%）的检测阳性率低于TPD，差异无统计学意义（P＞0.05）。两种方法对上述病原的诊断结果一致性较差（Kappa＜0.4）。此外，特殊病原如肺孢子菌（n=3，5.4%），毛霉菌（n=3，5.4%）及毛孢子菌（n=1，1.8%）均由mNGS 检测发现，TPD结果为阴性。

表3 mNGS与TPD检测结果比较

表4 常见病原mNGS与TPD检测结果比较

2.4 mNGS 与TPD 对多种病原混合感染检出率比较

45例mNGS 结果为阳性，其中16例检出一种致病原，29例检出≥2 种致病原。33例TPD 结果为阳性，其中21例检出一种致病原，12例检出≥2 种致病原。mNGS 检出≥2 种病原混合感染的比例显著高于TPD，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 两种方法不同病原检出种类分布[n (%)]

3 讨论

本研究中mNGS 对于致病性微生物的检测阳性率明显高于TPD（80.4%对58.9%），这与以往的研究结果一致[12]。但是，McNemar 检验结果显示mNGS 与TPD 检测一致性较差，表明两种方法互为补充，而不能互相替代。

初始抗感染治疗失败的白血病合并FN 患儿最容易继发真菌感染，无论血流感染还是肺部感染，曲霉菌已取代念珠菌成为FN儿童最常见的真菌感染，IPA 也是最常见的引起FN 儿童死亡的原因，这与国外报道一致[13]。究其原因：中性粒细胞作为天然免疫系统的主要吞噬细胞，可以抑制真菌发芽或杀死分生孢子[14]；中性粒细胞表达C型凝集素受体，产生活性氧并促进宿主防御[15]，故FN 患儿对真菌易感性增加。曲霉菌培养阳性率极低，血清学检测（GM试验）仅能提示可能存在曲霉菌感染，且抗真菌药物的预防使用亦大大增加了FN 患儿中GM 的假阴性率[16]。而mNGS 针对的是病原体的核酸序列，受到抗感染药物影响小，因此，对曲霉菌的检出率显著高于TPD。

细菌性致病微生物中鲍曼不动杆菌最常见，这与国外的一项针对儿童的研究[17]不一致，可能与研究对象不同有关。本研究的对象为初始抗感染治疗失败的白血病合并FN 患儿，多处于严重粒细胞缺乏阶段（ANC＜0.1×109/L），而中性粒细胞是抵御鲍曼不动杆菌感染最主要的屏障之一[18]，中性粒细胞减少会损害病原体清除和防御屏障的功能，此阶段更容易继发鲍曼不动杆菌感染。本研究中血流感染组mNGS 对鲍曼不动杆菌检测阳性率显著高于TPD；而肺部感染组mNGS 阳性率低于TPD，但差异并没有统计学意义。肺部感染组mNGS 对鲍曼不动杆菌的检测阳性率低于TPD，分析原因：①肺部感染组留取了肺泡灌洗液标本，对标本培养的同时还进行了多重PCR 检测，一定程度上增加了TPD 检测阳性率；②肺泡灌洗液标本的TPD 检测时机早，抗生素应用带来的病原菌破坏对病原检出率的影响小；③行mNGS 检测的时间为FN 后2 周左右，延迟采集的标本中病原菌的核酸序列减少，而mNGS 技术中对核酸序列读取长度较短，在50bp至300bp之间[19]，且含量低的序列可能不会被扩增，进而导致某些信息的丢失，出现假阴性结果。

本研究通过mNGS 技术，在血流感染组检测出包括EBV 和CMV 在内的病毒感染，均为与细菌或者真菌的混合感染。接受化疗及免疫抑制治疗的白血病患儿免疫机制受到严重破坏，是多种病原混合感染的高危人群[20]。本研究发现mNGS 对混合感染的检出率明显高于TPD，这与以往的研究结果一致[21]。虽然对混合感染的抗感染治疗有效缓解了症状，但很难区分具体病原体种类。对此可能的解释是，混合感染患儿的免疫特征因人而异，病原体在不同患儿之间的毒性可能不同，因此，临床医师需要准确把握不同病原体的致病机制，才能作出恰当的临床诊断和合理用药。

与TPD 相比，mNGS 对罕见病原的诊断效能更为突出。本研究通过mNGS 检出3例肺孢子菌、3例毛霉菌和1例毛孢子菌，上述3种病原引起的侵袭性真菌病可引起组织破坏、进展迅速、全因死亡率高，临床确诊十分困难。因此，对白血病FN 患儿早期行mNGS检测显得尤为必要。

本研究存在一定局限性，首先本研究为回顾性，样本量有限，研究对象化疗药物使用情况不同，因此需要多中心、大样本量、前瞻性的研究，以进一步证实相关结论。其次，mNGS 对病原体的诊断目前尚无统一标准，mNGS 检测结果必须在临床背景下进行解释[22]，判定结果可能带有一定的主观性。再者，各种病原检出的例数较少，因此，本研究未对mNGS 检测的序列数进行相关研究，需对单一病原进行大样本量的研究，以进一步探讨mNGS 序列数对各种病原的临床意义。最后，mNGS 目前无法提供药敏/耐药谱，限制了其在临床实践中的常规使用。

总之，对于初始抗感染治疗失败的白血病合并FN 患儿，最常见的致病原为曲霉菌、念珠菌和鲍曼不动杆菌。与TPD 相比，mNGS 对常见病原检测阳性率更高，对混合感染和TPD 难以确诊的罕见病原检测效能突出。而延迟进行mNGS 检测可能会降低其阳性率。因此，建议对白血病化疗后FN 的患儿尽早行mNGS 检测，作为TPD 的补充，以期早期明确病原并针对性抗感染，进而改善预后。