川崎病患儿树突状细胞亚群变化及意义初探

王娜娜 孟丽君 张欠文 张 帆 侯 淼 陈 烨 王 波 严文华吕海涛 孙 凌 黄 洁

苏州大学附属儿童医院 1.心内科，2.血液科，3.呼吸内科（江苏苏州 215025）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是以全身广泛性中小血管炎为主要病理特征的免疫性疾病，好发于5岁以下儿童，最易累及冠状动脉[1]。近年来，KD的发病率逐年上升，已成为儿童后天性心脏病的首要病因。近年文献报道，新型冠状病毒感染后临床症状类似KD 的表现，这越来越受到重视[2-3]。尽管大多数证据支持免疫介导的炎症在KD 的病理生理学中起着重要作用，但KD 的发病机制尚未完全阐明。KD 尸检患儿及动物模型均证实冠状动脉损伤部位浸润了大量活化的树突状细胞（dendritic cell，DC）[4-5]，但有关KD 患儿外周循环DC 亚群数量及功能变化的国内外研究报道较少。

DC 是一群高度异质性的专职抗原递呈细胞，在固有免疫和适应性免疫中起关键作用。目前根据其分布、表型和功能将DC 分为髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，mDC）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）两大主要亚群，人类mDC 表达典型的髓系标志物，可进一步分为CD 1 c+和CD 141+两大亚群，CD 1 c+mDC 是mDC 主要亚群，而pDC 通常缺乏这些髓系细胞表面标志物的表达，其亚群数量异常或功能障碍可导致疾病的发生发展[6-8]。本研究检测KD 患儿静脉用免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治疗前、后DC 亚群pDC 和CD 1 c+mDC 细胞比例、数量和表面功能分子（HLA-DR、CD 86、CD 40）的变化，探讨DC 在KD 中的免疫调节作用及其临床意义。

1 对象和方法

1.1 研究对象

回顾性分析2020年12 月—2021年5 月在苏州大学附属儿童医院心内科就诊的KD 患儿的临床资料。研究对象入选标准：①年龄＜14 岁，性别不限；②初次发病，符合美国心脏病协会制定的KD 诊断标准[9]；③急性期（发热10 天内）入院；④近2周内未接受肾上腺皮质激素及其他免疫抑制剂治疗。排除标准：①入院治疗前已行IVIG治疗；②合并心血管及血液系统等疾病。健康对照组为同期门诊体检的健康儿童，纳入标准：年龄＜14 周岁，性别不限；近2 周内未接受过免疫调节剂等药物治疗。排除感染性、心血管等其他疾病。

本研究获得家属知情同意及苏州大学附属儿童医院的伦理审核（No.2021CS090）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 对照组儿童在就诊当天，KD患儿分别于IVIG 治疗前1 天和治疗后第3～4 天取2 mL外周静脉血，分别用于检测外周血中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）及外周血DC亚群及表型。

1.2.2 外周血DC 亚群及表型检测 将1 mL 外周血转入15 mL 离心管中，加入3～5 倍体积的红细胞裂解液重悬细胞，混匀后置室温10 min，离心力400×g离心5 min 后弃上清液，PBS 洗涤2 次后用100 μL 流式染色液重悬细胞，然后分别加入Lin（CD 3、CD 14、CD 15、CD 16、CD 19、CD 20、CD 56）-FITC、HLA-DR-PE-Cy 7、CD 123-APC、CD 1 c-PE、CD 86-PE/CY 7、CD 40-BV 421、7-氨基放线菌素D-7-AAD 各5 μL，对照管加同型荧光标记的鼠抗人IgG，4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗涤1 次后用400 μL 流式染色液重悬细胞，立即用Attune NxT流式细胞仪对样本进行检测。DC亚群定义为Lin-HLA-DR+，pDC 为Lin-HLA-DR+CD 123+，CD 1 c+mDC 定义为Lin-HLA-DR+CD 1 c+（图1）。pDC 及CD 1 c+mDC 亚群中表面功能分子HLA-DR、CD 86 和CD 40 的表达水平采用平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示。

图1 KD 组IVIG 治疗前后及对照组pDC 和CD1c+mDC流式细胞图

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。非正态分布计量资料以M（P25～P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。两变量之间相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

符合纳入标准的KD 患儿34例，剔除2例数据不全者，共32例（KD 组）纳入分析，男19例、女13例，中位年龄37.0（22.3～58.5）月。健康对照组23例，男14例、女9例，中位年龄52.0（30.0～65.0）月。两组年龄及性别比较差异无统计学意义（Z=1.30，χ2=0.01，P均＞0.05）。

2.2 KD 组和对照组pDC 和CD 1 c+mDC 比例和数量比较

KD 患儿IVIG 治疗前组、治疗后组和对照组之间pDC、CD 1 c+mDC 占外周血总DC 比例和数量差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗前组、治疗后组的pDC、CD 1 c+mDC 占外周血总DC 比例均低于对照组，治疗后组CD 1 c+mDC 占外周血总DC 比例高于治疗前；治疗前组pDC、CD 1 c+mDC 数量均低于对照组和治疗后组，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后组pDC、CD 1 c+mDC 的数量与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 外周血pDC 和CD 1 c+mDC 表面HLA-DR、CD86、CD40表达比较

KD患儿IVIG治疗前组、治疗后组和对照组之间pDC表面CD86、CD40以及CD1c+m D C表面HLA-DR、CD 86 表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗前组pDC 表面CD 86、CD 40 水平低于对照组和治疗后组；治疗前组CD 1 c+mDC 表面HLA-DR、CD 86 的水平低于对照组和治疗后组，治疗后组的CD 86 水平仍低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.4 pDC和CD1c+mDC水平与实验室指标相关性

Spearman 相关性分析显示，急性期KD患儿pDC细胞数量与CRP、中性粒与淋巴细胞比值（NLR）均呈显著负相关（rs=-0.44、-0.52，P均＜0.05）。CD 1 c+mDC 细胞数量与CRP、NLR、ESR均呈显著负相关（rs=-0.67～-0.42，P均＜0.05）。

3 讨论

DC 是唯一能活化初始T 细胞的抗原递呈细胞，在病原体识别、免疫反应调节和炎症反应中发挥重要作用[10]。它起源于骨髓造血干细胞，广泛分布于全身各组织和器官。根据分布、表型和功能可分为很多亚群，最常见的分类为mDC 和pDC、mDC 摄取、加工、递呈抗原后激活T细胞并诱导其分化为效应T细胞；pDC 主要是针对病毒感染迅速产生大量的Ⅰ型干扰素-α（IFN-α），参与免疫调控作用[6,10]。KD是以全身性非特异血管炎为病理改变的免疫性疾病。流行病学研究发现，感染等因素所诱导的免疫功能紊乱在KD的发病机制中起着重要的作用[1,11]。早期研究发现，KD患儿冠状动脉损伤部位浸润了大量的成熟DC[5]，但对于其外周循环中亚群数量和表型的相关研究较少。

表1 KD组IVIG治疗前后及对照组pDC和CD1c+mDC比例和数量比较[M (P25～P75)]

表2 KD组IVIG治疗前后及对照组pDC和CD1c+mDC表面HLA-DR、CD86及CD40表达比较[M (P25～P75)]

为避免体外丝裂原刺激的影响，本研究在未经体外培养的条件下观察到，急性期KD 患儿外周血与对照组相比，pDC 和CD 1 c+mDC 比例和数量均明显降低，IVIG 治疗后显著增加，提示DC 亚群分布异常可能与KD 的免疫发病机制有关。相关研究发现KD 患儿急性期外周血mDC 数量明显升高[12]，这可能与鉴定DC 亚群的分子表型标记方法不同及纳入研究的患儿疾病状态不同有关。KD 患儿外周血pDC和CD 1 c+mDC 水平降低可能由以下多种原因导致：①来源减少，即KD 患儿骨髓干细胞分化为DC 过程中存在异常；②DC 在外周循环中凋亡增加，早期研究发现KD 患儿淋巴细胞数量的减少与其凋亡增加有关[13]；③去路增多，即外周血DC在多种趋化因子的刺激下向淋巴组织和心脏冠状动脉等靶器官迁移和归巢增加。

D C 的功能与其成熟状态密切相关，成熟DC 不仅高表达主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility class II antigens，MHCⅡ）和共刺激分子（CD 86、CD 80、CD 40）等，还能分泌细胞因子使初始T细胞完全活化、增殖，激活免疫应答。不成熟DC（immature DC，imDC）低表达MHC 分子和共刺激分子，诱导T细胞无能或低反应性，从而导致自身的免疫耐受[14]。未成熟DC具有较强的抗原摄取能力和较弱的抗原提呈能力，成熟的DC在炎症因子的刺激下则失去其抗原摄取能力并获得向淋巴细胞递呈抗原的能力。为深入了解pDC 及CD 1 c+mDC 细胞的功能状态，进一步对pDC 及CD 1 c+mDC 表面活化及成熟等功能分子分析发现，与对照组相比，KD患儿外周血pDC 表面分子CD 86 及CD 40 的表达水平明显降低，CD 1 c+mDC 表面分子HLA-DR 及CD 86 明显降低，IVIG治疗后呈不同程度恢复。以上结果表明，急性期KD 患儿外周血DC 可能处于不成熟或者免疫耐受状态，与成熟的DC迁移到外周炎症部位增加和/或未成熟的DC从骨髓流入外周循环增加可能有关。提示外周血循环中pDC 和CD 1 c+mDC 数量和功能的异常可能在KD的发病过程中起一定作用。

CRP、NLR和ESR升高是炎症反应加剧的标志[15]。本研究相关性分析显示，pDC 和CD 1 c+mDC 细胞数量与CRP 及NLR 均呈显著负相关，CD 1 c+mDC 还与ESR 呈显著负相关，提示DC 亚群数量变化可能成为监测KD患儿病情变化的重要指标。

本研究显示，KD患儿外周血pDC及CD1c+mDC 细胞数量和比例均明显降低，同时伴随细胞表面多种功能相关分子表达下调，提示DC 可能参与了KD 的发生与发展，深入研究DC 亚群的功能可能对揭示KD 的发病机制具有重要意义。IVIG治疗后DC 亚群和表面功能分子表达水平增高有助于KD 患儿机体免疫平衡的恢复。由于样本量有限，DC 亚群水平与KD 患儿IVIG 治疗的敏感性关系以及与冠脉动脉损伤严重程度关系有待于扩大样本量进一步深入研究。