曲霉菌半乳甘露聚糖抗原提取工艺优化

刘春龙

摘 要：近年来，随着科技的发展，广谱抗生素及免疫抑制剂在临床被广泛使用，免疫缺陷患者、癌症患者、器官移植患者及血液病患者等感染侵袭性真菌病概率急剧升高。真菌病感染如果不能早期治疗，死亡率极高。其中，曲霉特别是烟曲霉（Aspergillus fumigatus）已经逐渐成为临床上一种重要的致病真菌。目前传统的侵袭性曲霉菌感染检测的金标准是无菌体液培养和组织活检。但传统的分离培养的方法阳性率低、周期长，极大的贻误病情，因此，检测烟曲霉抗原是目前临床公认的快速早期诊断烟曲霉菌感染的有效方法。烟曲霉菌的主要抗原成分是半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM），所以血清中GM抗原检测是一种快速、高效、特异性的早期诊断曲霉菌感染的方式。目前国内对曲霉菌半乳甘露聚糖提取纯化的研究不多，本次研究以烟曲霉的菌体为原料，研究了GM抗原的提取工艺及后期纯化的方式。通过液氮研磨、超声等方式对曲霉菌半乳甘露聚糖进行提取，获得粗提物后用无水乙醇以及水肼和亚硝酸处理。并将上述处理得到的溶液用MonoQ层析柱及超滤技术进行抗原纯化，最终获得了GM抗原纯品。通过紫外分光光度及液相色谱等技术对提取的抗原进行验证，发现通过优化曲霉菌半乳甘露聚糖提取工艺制备得到的半乳甘露聚糖抗体的得率较高且纯度较好。

关键词：曲霉菌；半乳甘露聚糖；侵袭性真菌病；优化工艺；生物活性

中图分类号：R44 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）27-0052-02

常见的真菌比细菌大几倍甚至几十倍，因此结构也比细菌要复杂得多。真菌与细菌相比，细胞壁较厚，约占干重的30%以上，但真菌细胞壁缺乏黏肽，而是由结构不同的多糖如甘露糖、葡聚糖、脱乙酰壳多糖及几丁质等组成，部分还含有蛋白质及类脂体成分[1]。

GM抗原广泛存在于曲霉菌属的菌丝及孢子中，在部分植物中也会存在这种成分，比如大豆，GM抗原干粉的外观为白色、粉末状，在酸、盐环境下有极好的耐受性，比较耐热，在水中溶解度非常大，可形成透明溶液，GM抗原是一种以甘露聚糖为主链，以呋喃半乳糖为侧链的多糖。

根据不同的GM抗原中甘露聚糖与呋喃半乳糖的比例不同，从不同植物或真菌提取的抗原有很多不同的应用[2]。提取自豆类等植物中的半乳甘露聚糖具有很低的热量，常被用于食品行业生产中作为黏稠剂和稳定剂使用，而且半乳甘露聚糖还具有很多生理功能，广泛应用于医药和美容中。在烟曲霉整个生产周期中，GM抗原最早在稳定期出现，从菌丝端进行释放，GM抗原也是最早释放的曲霉菌的抗原，而GM抗原也是烟曲霉菌细胞壁独有的组成部分，它还是一种致病性抗原，常作为临床检测和诊断的标志物[3]。

鉴于烟曲霉主要细胞壁成分为半乳甘露聚糖，其他种类的多糖量很少，因此考虑通过液氮及超声波处理提高烟曲霉粗提物的得率。在利用超滤技术可有效去除溶液体系中特定分子量以下的高分子有机物[4]。对烟曲霉抗原粗提物进行纯化，从而获得了纯度在93%以上的半乳甘露聚糖抗原。本方法原理简单，操作时间短，条件易掌控，便于批量生产，非常有利于作为抗体生产过程的免疫原制备。

1 材料与方法

1.1 材料

本论文所采用的烟曲霉菌株购买自中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）。

1.2 实验方法

1.2.1 烟曲霉菌活化及培养

配制沙氏液体培养基及配制沙氏固体培养基：之后将液体培养基趁热倒入干燥无菌的培养皿中，每个培养皿倒15ml；在室温下，生物安全柜中融化-20℃保存的菌液，每块培养皿涂50μL，涂2块，用封口膜封好，30℃培养2-3天。

待平板上菌体长大变绿之前，在平板上划线转接，用封口膜封好，30℃培养2-3天；待平板上菌体长大变绿之前，将长有新生菌丝的培养基取小块，倒置转接到6个平板上，30℃培养2-3天[5]。

1.2.2 半乳甘露聚糖粗提物提取

从曲霉菌平板上取带有新生菌丝的小块培养基，转接在沙氏液体培养基上培养5-7天； 在沙氏液体培养基中加入甲醛溶液，使甲醛终浓度为3.7%，于4℃放置24小时灭活菌体；后用灭菌纱布过滤，用预冷的生理盐水重悬菌体后，反复洗涤6-10次；在离心后的沉淀物中加入液氮，用灭菌的研钵研磨破碎5次，加水（20倍），冰浴下使用探头式超声破碎仪，破碎30min，破碎液在-20℃冰箱中保存。

1.2.3 半乳甘露聚糖浓度的测定[3]

（1）配制5%苯酚溶液：量取一定量苯酚（AR），并对它进行高温蒸馏，在180℃进行收集馏分，再称取上述液体50g，用水溶解，最后定容于1000ml棕色容量瓶中，冷却避光保存。（2）配制葡萄糖标准液（200mg/L）：精称110℃恒重的葡萄糖20mg，用水溶解，定容至100ml；再精密吸取2.0，4.0，8.0，10.0ml分别置于100ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀即得葡萄糖稀释液。（3）样品的测定：加入2mL上述葡萄糖稀释液，加至25ml比色管中，加入1mL配制好的苯酚溶液，并立即加入5.0ml浓硫酸，充分摇匀，并在常温放置30min，各样品分别做两组平行。（4）标准曲线的制备：以上述2.0ml水的空白溶液做对照组，用紫外分光光度计在490nm波长处测定各样品吸光度，以标准液的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出葡萄糖标准品的标准曲线。

1.2.4 半乳甘露聚糖纯化

将所得粗提物转移至洁净烧杯中，按照体积比加入4倍體积无水乙醇。并放置在4℃冰箱进行过夜纯沉。对纯沉物进行收集，并溶于去离子水中。按照体积比加入4倍体积无水乙醇，静置1小时。对沉淀物再次进行收集，沉淀物用无水乙醇洗涤三次。离心并弃去上清。将所得沉淀物用去离子水溶解，并将活性炭加入到上述溶液中，用磁力搅拌器进行混匀3h。endprint

室温抽滤，除去活性炭颗粒。所得溶液经过0.22μm滤膜进行过滤。滤液转移至10KD离心超滤管，5000g离心10分钟。即得到半乳甘露聚糖纯品。

2 结果分析

半乳甘露聚糖提取实验影响因素分析。

（1）半乳甘露聚糖标准曲线。实验结果如图1，其线性回归方程为Y=0.0577X-0.1506，R2=0.9961。

图1 葡聚糖标准曲线

（2）用Dubois-硫酸苯酚法对本发明的制备方法得到的半乳甘露聚糖抗原纯化样品进行多糖含量测定，结果从5g烟曲霉菌体最终可得到150mg 半乳甘露聚糖抗原纯品。

（3）对本论文的制备方法得到的GM抗原纯化样品进行紫外吸收检测。分别在UV260纳米、UV280纳米、UV320纳米波长下检测样本，检测结果抗原濃度为1.35mg/mL含量占比93.18%，蛋白质浓度为87.64μg/mL含量占比为6.49%，DNA含量占比为0.33%。可见抗原纯度较高，能够达到93%以上。

对本论文的制备方法得到的GM抗原纯化样品进行HPLC检测。检测器为示差折光检测器，样品出峰单一，尖窄，并无明显杂峰出现，说明所含物质大小均一，纯度较高。

3 结束语

GM抗原是侵袭性曲霉菌感染诊断标准中重要的微生物学依据，对实现侵袭性曲霉菌感染的早期诊断，给临床提供辅助依据，同时动态监测血清水平GM变化有助于判断抗真菌治疗的效果。可见，拥有一套完整且高效提取半乳甘露聚糖抗原的工艺流程是广泛生产并应用ELISA检测试剂盒的关键，同时，半乳甘露聚糖具有生物活性，是医学上IFD体外诊断试剂开发的优质实验材料。

本实验通过对传统曲霉菌半乳甘露聚糖提取工艺流程优化改进，使半乳甘露聚糖的提取效率更加高效，增加生产的优势；用时短，易取材，操作简便。用该方法纯化的烟曲霉半乳甘露聚糖抗原能达到较高纯度。因此，这套工艺可用于血清半乳甘露聚糖检测试剂盒的研发、生产和应用。

参考文献：

[1]王丽.烟曲霉基因组与致病机制[J].中国真菌学杂志，2011，6（1）：1-2.

[2]廖万青.深部真菌感染主要病原菌的致病机理研究进展[A].2005全国首届深部真菌感染学术会议论文集[C].2005.

[3]徐杰伟，李启欣，何艳嫦.检测患者血清半乳甘露聚糖用于曲霉菌感染诊断的应用评价[J].检验与临床，2012，50（20）：74-75.

[4]车小燕，等.1组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国真菌学杂志.2008，3（3）：129-133.

[5]DIRK STYNEN，等.INFECION AND IMMUNITY.1992，60（6）：2237-2245.endprint