基于临床及肿瘤生物学特征的儿童髓母细胞瘤预后列线图构建及验证

张再禹 梁 平

重庆医科大学附属儿童医院神经外科 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室（重庆 400014）

髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）是0～14岁儿童中最常见的恶性颅内肿瘤[1]。当前MB 治疗共识是最大程度地安全切除肿瘤，然后根据风险分层进行多模式治疗。此外，风险分层也实现了临床试验中治疗强度的可控降级。在半个世纪的临床实践中最常用的分层系统是只包含了临床特征的Chang分期[2]，然而长期观察发现该系统在预测远期预后方面不令人满意，因为同组内患者的结局仍具有高度异质性。随着对MB 生物异质性认识的加深，一种更全面的、包含患儿临床特征和肿瘤生物学特性的风险分期方法呼之欲出。目前在病理诊断方面，只有组织学分型得到了广泛应用[3]，仍有许多蛋白标志物的预后预测潜力未被开发。虽然目前共识已经强调分子诊断的重要性[4]，但并非所有的患者都完成了昂贵的基因测试。为探讨是否可以关注某些蛋白质的表达，并结合患者临床特点构建一个新的长期病程预测模型，本研究收集行手术切除MB 患儿的临床资料，利用logistic及COX回归模型构建预后预测模型，并以列线图直观展示，使用C 指数、校准曲线及决策曲线分析（decision curve analysis，DCA）评价预测模型的预测效能，为MB 患儿术后管理提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2011年1 月1 日至2020年8 月1 日在重庆医科大学附属儿童医院诊断的158例MB 患儿的临床资料。患儿的临床和生物学信息常规记录在儿童医疗大数据智能应用重庆市高校工程研究中心。研究对象纳入标准：①年龄＜18 岁，男女不限；②在本院完成MB 切除手术；③手术前未接受任何放、化疗；④截止至2021年8 月31 日，患儿随访情况可以明确，术后情况可通过影像学结果确定并有知情同意过程。排除标准：①严重缺失研究相关资料；②未完成手术，包括术前放弃治疗、要求自动出院者。

本研究获医院医学伦理委员会批准，批准号：（2021）年伦审（研）第（406）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 包括患儿年龄、性别、磁共振成像（MRI）图像及报告、病理报告、手术记录、住院病程、治疗方式、门诊病历及生存情况等资料。

1.2.2 影像学资料 本院神经外科医师通过术前最后一次MRI确定肿瘤最大径、位置和转移及浸润，并通过手术记录印证。肿瘤位置分为小脑蚓部、四脑室内、小脑半球或桥小脑角。转移及浸润是指小脑和/或大脑的蛛网膜下腔和/或侧脑室或第三脑室肉眼结节状种植，脊髓蛛网膜下腔肉眼结节状种植，颅外转移。

1.2.3 病理资料 本院神经病理科医师遵循WHO 2007年和2016年指南出具病理报告[5-6]，从病理报告中获取病理资料。肿瘤组织学分型包括经典型、促结缔组织增生/结节型（desmoplastic/nodular，DN）、广泛结节型（MB with extensive nodularity，MBEN）、大细胞型/间变型（anaplastic/large cell，LC/A）或非定型（not otherwise specified，NOS）。通过在多个高倍视野中观察有丝分裂活动程度定性评估核分裂像增加；通过免疫组化确定MYC、p 53 和Ki 67 蛋白表达情况。p 53 蛋白以染色50%为标准分为阳性或阴性[7]。当肿瘤标本中＞50%的细胞显示C-MYC或N-MYC 蛋白在核和/或细胞质表达时，MYC 记为阳性[8]。

1.2.4 结局 短期结局（short-term outcomes，STO）：术后1 个月内的第一次MRI 扫描发现残留病灶＞1.5 cm2。长期结局（long-term outcomes，LTO）：下列任一情况首先发生，包括肿瘤复发、再次手术和死亡。肿瘤复发：术后1 个月内MRI 未发现残留，但之后原发部位或远处再次出现肿瘤，或残留病灶明显增大。再次手术：从术后第2个月开始的长期MRI随访中，因为残余肿瘤存在手术指征或肿瘤进展、复发而考虑手术。通过门诊病历结合电话随访确定患儿生存情况，并未明确所有患儿死因。无LTO 生存期（LTO-free survival，LOFS）：指从患儿初次术后开始至第一次出现LTO的时间。

1.2.5 分组 当前手术技术无法处理微小残留、转移和浸润病灶，基于临床经验及文献，若术后残留病灶＞1.5 cm2或影像学发现有浸润及转移，患儿长期预后可能不佳[9-10]，所以为反映患儿术后肿瘤细胞残留情况对LTO 的影响，根据患儿是否发生STO 或浸润及转移将其分为高风险组和低风险组。

1.3 统计学分析

采用X-tile软件确定最佳界值（version 3.6.1；Yale University，New Haven，CT，USA）[11]：患儿年龄为3岁，肿瘤直径为5.0 cm，Ki67指数为60.0%。采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示，非正态分布的以M（P25～P75）表示。计数资料以例数（百分比）表示。采用Akaike信息准则估计模型的拟合度[12]。使用后退法构建多因素logistic回归模型1（model 1，M 1）预测STO，并采用Hosmer-Lemeshow 检验确定其最佳拟合度，采用灵敏度、特异度、阳性及阴性预测值和ROC 曲线下面积（AUC）评价模型的预测效果。使用Kaplan-Meier法和log-rank检验计算LOFS。使用单因素Cox回归分析剔除P＞0.1的无意义变量，保留可能有意义的变量（0.05＜P＜0.1），并计算风险比（hazard ratios，HR），使用向后选择变量构建多因素COX 回归模型。通过R 语言的rms 包（4.1.0）使其以列线图的形式展示，并使用C 指数、校准曲线评价模型。采用R 语言的ggDCA 包进行DCA 进而评估其临床效用[13]。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线特征、病理资料和结局

根据纳入及排除标准，158例患儿中111例MB患儿被纳入研究，男67例、女44例；中位年龄7.0（4.0～9.0）岁，≤3岁25例。99例患儿在术后接受了系统化疗，其中53例同时接受放射治疗；11例因病情进展加重无法进行术后放化疗；1例因经济原因放弃术后后续治疗。中位随访时间17.0（10.0～29.0）月。27例肿瘤直径＞5 cm。肿瘤位置主要位于小脑蚓部及四脑室内（占88.3%），其余10.8%的肿瘤位置在小脑半球，仅1例发现于桥小脑角。35例患儿在诊断时已发现肿瘤转移及浸润。20例患儿发生STO；39例在长期随访中出现肿瘤复发，有6例再次手术，13例死亡。见表1。本队列中3年及5年生存率分别为（88.1±3.4）%及（82.6±6.2）%。

表1 111例MB患儿临床及肿瘤生物学特征

2.2 STO及LTO预测模型

首先使用后退法构建多因素logistic回归模型预测STO，自变量为年龄、性别、肿瘤直径、位置、影像学转移、组织学类别、核分裂像、Ki 67 指数、MYC和p 53 阳性。其中肿瘤直径＞5.0 cm（OR=8.07，95%CI：2.62～24.89，P＜0.001）和MYC 阳性（OR=4.03，95%CI：1.29～12.63，P=0.017）被纳入M 1（Hosmer-Lemeshow 检验计算得χ2＜0.001，P=1.000），其余自变量则被移出模型。M 1 预测STO 的特异度为95.6%，灵敏度40.0%，阳性及阴性预测值分别为66.7%和87.9%，AUC为0.81（95%CI：0.69～0.92，P＜0.001）。其校准图见图1。

图1 M1 的校准曲线

50例MB 患儿归入高风险组，12 个月LOFS 为（46.0±7.0）%；低风险组61例，12 个月LOFS 为（80.3±5.1）%，两组间差异有统计学意义（HR=2.77，95%CI：1.53～5.01，P＜0.001）。按临床和生物学参数对LTO 进行单因素COX 回归，结果发现，高风险组、年龄≤3 岁和肿瘤直径＞5.0 cm 与不良LTO明显相关（P＜0.05），在蛋白质表达和增殖标志物中，MYC 阳性是较差LTO 强有力的独立预测因素（P＜0.05），见图2。

结合基线参数及风险分组进行多因素COX 回归建模预测LTO，并以列线图展示（图3 A），最终纳入年龄（≤3岁对＞3岁）、肿瘤直径（＞5.0 cm对≤5.0 cm）、MYC蛋白（阳性对阴性）和风险分组（高风险对低风险）。该模型的C 指数为0.715，预测12和18个月的LOFS时校正曲线均贴近于理想曲线（对角线），列线图预测概率同实测值基本一致（图3 B、3 C），且由DCA 曲线可知，列线图模型的预测概率阈值在较大范围内时其净收益均较高（图3D、3E）。

3 讨论

图2 影响LOFS 的单因素COX 回归分析结果

图3 预测MB 患儿LTO 风险的列线图及预测不同时间LOFS 的校准曲线和DCA 曲线

本项单中心、回顾性队列研究开发并验证了一种肿瘤生物学特征结合患儿临床特征的新型预后预测工具，因为MB 复发的中位时间主要在诊断后两年内[14-15]，所以预测了12 和18 个月的LOFS，C-指数及校准曲线均显示模型具有不错的预测效果，并且列线图在DCA 中展现出良好的临床效能。本研究发现，高和低风险组患儿的LOFS 明显不同，在单因素及多因素COX 回归中风险分组均与LTO 显著相关。残余肿瘤细胞会增加复发、进展甚至死亡的概率[9-10]。Chang等[2]的第一个风险分级系统就已经考虑到转移对患者预后的影响[2]。20世纪末Zeltzer等[16]在Chang等[2]的基础上纳入了术后残余这一指标。在1990年以前，有残余肿瘤灶和转移的MB 患儿无事件生存率一直低于50.0%[16-18]。当前包括大剂量化疗、全脑脊髓放疗在内的术后规范综合治疗已经改善了这一困境，并且5年生存率也已超过70.0%[19-21]。

针对模型中确定的变量并结合以往的经验，我们的观点是：第一，针对病灶残余，对于手术实现了全切但肿瘤体积较大和MYC 阳性患儿、接受次全切除手术患儿、术中直视下未见残留但术后MRI 提示残留的患儿以及存在手术无法处理的浸润和转移的患儿，均需要更积极的治疗以延长生存期。历史上肿瘤直径被纳入了首个MB 分期系统[2]，结合M1和列线图我们提出第二个关于肿瘤直径的观点。较大的肿瘤通常难以全切，肿瘤残留会导致预后较差，但随着手术技术发展，肿瘤的位置、构造和邻近结构似乎比大小更有意义，但上述分析和现有的分期系统中没有系统地考虑这方面，例如手术对下蚓部、小脑顶核和小脑传出通路的损伤会导致小脑缄默综合征和小脑认知-情感综合征[22-24]。第三，根据以往的观点，≤3 岁MB 患儿的预后明显更差，但年龄作为风险分层变量值得商榷。考虑到治疗毒性，年幼和年长儿童的治疗方法不同，这一差异可能会造成预后的差异。相关研究发现，不使用全脑脊髓放疗而单独接受大剂量化疗的低龄患儿疗效很差，他们可能需要额外的治疗，如减量放疗、脑室内/玛雅囊内注药化疗或巩固治疗后的周期性生物治疗[21]。随着对MB 患儿预后的临床危险因素更深层次的理解，简明的生物标记物已成为目前及未来的探索重点。自从相关研究强调对MYC扩增的MB 患儿应考虑强化治疗策略[25]以来，许多关于MYC基因水平的研究都证实其与不良预后有关[26]，并发现MYC在Mad/Max 信号轴的下游发挥作用，最终调控细胞周期、凋亡活性和细胞分化[27]，这也解释了为什么MYC 蛋白表达可预测肿瘤残留和预后情况。然而，在蛋白质水平上，这种相关性仍未被证实[28-29]。原因可能是在本研究中，当＞50%的肿瘤细胞被染色时该切片即被评为阳性，而不管蛋白是在细胞核还是在细胞质中定位，这种方法与相关研究一致，同样，他们也证实MYC蛋白表达是预后不良的标志[8]。最后一个观点遂得出，MYC基因扩增或蛋白高表达的患儿需要在管理策略上予以重点关注。

本研究构建了列线图来预测MB 患儿发生LTO的风险，尽管该模型与既往的危险分层有重合部分，如Chang 的M 分期和年龄，但该列线图首先将患儿分为能够反映术后肿瘤残留情况的高、低风险组，新颖地纳入了反映肿瘤在蛋白水平上生物异质性的MYC 蛋白表达情况，并且其临床效能在所有的内部验证方法中都得到了验证。此基于临床-生物学的列线图可能为临床工作中预测MB 患儿预后提供了一个简单而准确的方法。

本研究有几个局限性。首先模型的建立基于回顾性、单中心资料，并且由于样本量不足，也无法对该模型进行外部验证；随访的中位数不足两年，可能对MB 患儿来说随访时间不足；本研究仅将病理报告中含有MYC 蛋白信息的患儿纳入队列，这造成了样本量减少和选择偏倚。最后，MYC 在DNA、RNA 及蛋白水平上的差异原因仍是未知的，是否在DNA 及RNA 水平上的异常是由于其他相关通路表达上调的替代标记，也许是由相同转录元件控制的，这一点可能需要由未来基础研究通过比较MYC DNA、mRNA和蛋白水平差异来澄清。