miR-143-3p通过SIRT2调控LPS诱导牙周膜细胞炎症、凋亡的研究*

刘 沛 王清芝

牙周炎是一种十分常见的慢性炎症性疾病，其特征为口腔微生物引起的炎症反应及牙齿周围结缔组织的破坏[1]。世界上重度牙周炎的发病率为11%[2]，若不及时医治将导致牙周结构的破坏，最终导致牙齿脱落。因此，牙周炎的发病机制研究对该病的预防和治疗具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是炎症的重要调节因子，参与牙周炎的发病机制[3]。miR-143-3p是近期发现的牙周炎相关新miRNA之一[4]。Sirtuins是一种从细菌到人类高度保守的去乙酰化酶类。乙酰化是一种蛋白质的翻译后修饰，它可影响蛋白质的催化活性、稳定性及与其它蛋白质或染色质的结合能力。Sirtuins有助于组蛋白、转录因子和胞质蛋白的去乙酰化，以调控蛋白的功能[5，6]。SIRT2多位于细胞质，其底物分为组蛋白和非组蛋白，其功能异常可能与多种疾病的发生和发展相关[7]。本研究旨在探究miR-143-3p在LPS诱导的hPDLCs细胞中的表达及调控细胞炎症反应和凋亡的作用机制，为牙周炎的医治提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 材料 人牙周膜细胞（hPDLCs）来自本医院口腔科2021年2月接收的10-14岁正畸要求拔牙的健康患者1例；αMEM培养基购自广州展晨生物；人肿瘤坏死因子α（TNFα）ELISA检测试剂盒、人白细胞介素1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒均购自北京索莱宝生物科技公司；膜联蛋白V-碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自上海Bestbio公司；荧光聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒购自日本Takera公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国赛默飞世尔公司；antagomiRNA、antagomiR-143-3p、pcDNA、pcDNA-SIRT2、si-NC、si-SIRT2及所有引物的设计、合成均委托上海吉玛完成。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜细胞的培养与分组 手术拔除的牙用1%双抗的无血清αMEM充分冲洗，再放在10%血清的αMEM培养液。无菌手术刀刮取牙周膜组织块，充分剪碎，再用αMEM培养液洗涤5次，收集沉淀。再用Ⅰ型胶原酶，消化细胞1 h，中途查看要换3次。如此，重复用Ⅰ型胶原酶消化3次，收集细胞。开始用10%胎牛血清+1%双抗的αMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱培养，隔2 d更换一次培养液，至细胞爬出组织块。待细胞铺满底部，用0.25%胰酶消化，收集细胞，开始正常的传代培养，将此细胞记为原代hPDLCs，并鉴定。培养至第5代的细胞用于后续的实验研究。取对数期的细胞液氮冻存，备用。

将正常培养的3代hPDLCs细胞随机分为对照组、模型组；antagomiRNA组、antagomiR-143-3p组、pcDNA组、pcDNA-SIRT2组、antagomiR-143-3p+si-NC组、antagomiR-143-3p+si-SIRT2组细胞在脂质体转染至正常hPDLCs细胞后进行LPS的致炎损伤处理。RT-qPCR法检测转染的效果。

1.2.2 MTT法检测细胞活性 将正常培养的3代hPDLCs 细胞设为对照组；用LPS（1 ug/mL）处理hPDLCs细胞12 h，作为牙周膜细胞的炎症模型，设为模型组。收集培养48 h的细胞，浓度为0.5×105个/mL。1000个细胞/孔，分装至96孔板，37℃培养4 h，加入MTT溶液（5 mg/mL）10 ul，继续培养4 h。最后加入DMSO溶液，震荡使结晶溶解。最后在490 nm波长下检测细胞的吸光度（OD490）。实验重复3次，每次做3个平行重复，每个样本共重复9次。

1.2.3 RT-qPCR实验检测miR-143-3p、SIRT2、NLRP3、Caspase-1 的表达 使用脂质体将antagomiRNA、antagomiR-143-3p、antagomiR-143-3p+si-NC、pcDNA 组、pcDNA-SIRT2 组、antagomiR-143-3p+si-SIRT2 转染至细胞，antagomiRNA组、antagomiR-143-3p组、antagomiR-143-3p+si-NC组、antagomiR-143-3p+si-SIRT2组细胞，培养48 h时收集。TRIzol液提取上述各组细胞及对照组、模型组细胞的总RNA。使用反转录试剂盒将其合成cDNA，-20℃保存备用。qPCR试剂盒用于 检 测cDNA 中miR-143-3p、SIRT2、NLRP3、Caspase-1的表达。以U6、GAPDH为内参，2-△△Ct法计算检测指标的相对表达量。95℃反应5 min，60℃反应30 s，45个循环。引物信息：miR-143-3p，上游引物5′-TGAGATGAAGCACTG-3′，下 游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 ，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT；GAPDH，上游引物5′-CCAGTGCAAAGAGCCCAAAC-3′，下游引物5′-TCCCGTTTCACTTGTCTCGG-3′；SIRT2，上游引物5′-TCCACCAAGTCCTCCTGTTC-3′，下游引物5′-TGAAGGACAAGGGGCTACTC-3′；NLRP3，上 游 引 物5′-CCCTTGGAGACACAGGACTCA-3′，上 游 引 物 5′-TGAGGCTGC AGTTGTCTAATTCC-3′；Caspase-1，上游引物5′-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3′，下游引物5′-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3′；GAPDH，上游引物5′-CCAGTGCAAAGAGCCCAAAC-3′，下游引物5′-TCCCGTTTCACTTGTCTCGG-3′。实验重复3次，每次做3个平行重复，每个样本共重复9次。

1.2.4 ELISA实验检测细胞上清TNFα、IL-1β的含量 收集细胞培养液，分别按照TNFα 、IL-1β的双抗体夹心ELISA法检测TNFα、IL-1β的含量。详细的操作步骤，按照试剂盒中的说明书操作步骤要求操作，加入终止液后均在450 nm 波长下检测TNFα、IL-1β的吸光值，判定样本中TNFα、IL-1β的含量。颜色越深，上清中TNFα、IL-1β的含量越高，OD450吸光值越高。实验重复3次，每次做3个平行重复，每个样本共重复9次。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率 收集antagomiRNA组、antagomiR-143-3p组、antagomiR-143-3p+si-NC组、antagomiR-143-3p+si-SIRT2组培养48 h的细胞及对照组、模型组培养48 h的细胞。4℃的PBS洗涤，500 ul结合缓冲液制成105个细胞的重悬液。再加入Annexin VFITC、PI，混匀，避光孵育。结束后将细胞置于冰上，尽快上流式细胞仪检测凋亡情况。细胞总凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。实验重复3次，每次做3个平行重复，每个样本共重复9次。

1.2.6 WB实验检测细胞SIRT2蛋白表达 收集antagomiRNA 组、antagomiR-143-3p 组、antagomiR-143-3p+si-NC组、antagomiR-143-3p+si-SIRT2组培养48 h的细胞及对照组、模型组培养48 h的细胞，RIPA冰上裂解30 min，超声裂解2 min，12000 rpm/min离心5 min，收集总蛋白。定量变性后，行SDS-PAGE蛋白电泳、转膜及封闭。将膜进行一抗孵育：1000倍稀释的兔抗SIRT2多抗溶液孵育，4℃，12 h。二抗孵育：将膜浸入500 倍稀释的HRP标记的山羊抗兔溶液，孵育，37℃2 h。显色：ECL发光液显色，曝光。Image J 软件处理分析蛋白灰度。实验重复3 次，每次做3 个平行重复，每个样本共重复9 次。

1.2.7 双荧光素酶报告实验检测细胞荧光强度 Starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-143-3p的下游靶基因，发现SIRT2为其中之一。根据预测到的结合靶点化学合成含有结合位点的SIRT2 核酸片段（SIRT2-WT）、不含结合位点的SIRT2 核酸片段（SIRT2-MUT），插入荧光载体，构建荧光报告基因载体。将其分别与agomiRNA、agomiR-143-3p、antagomiRNA、antagomiR-143-3p 共转染至hPDLCs 细胞。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明书要求操作，检测hPDLCs细胞的荧光活性。

1.2.8 统计学处理SPSS 26.0分析实验数据。均数±标准差（±s）表示数据，行t检验或F检验比较差异，P＜0.05表示有统计意义。

2.结果

2.1 LPS 诱导的hPDLCs 细胞模型的建立及miR-143-3p的表达 取第3代培养48 h的hPDLCs细胞，在显微镜下观察细胞的形态，如图1A所示。与对照组相比，模型组细胞TNFα、IL-1β升高，细胞活性低，细胞凋亡率升高（图1B），miR-143-3p表达升高（P＜0.05），见表1。

图1 hPDLCs鉴定图及模型细胞凋亡情况A：hPDLCs细胞鉴定图；B：LPS诱导的hPDLCs细胞凋亡图

表1 LPS诱导hPDLCs细胞

2.2 抑制miR-143-3p对LPS诱导的牙周膜细胞炎症、凋亡的调控 结果如表2 和图2 所示，与antagomiRNA组相比，antagomiR-143-3p组细胞中miR-143-3p的表达显著降低，NLRP3、Caspase-1的mRNA表达均显著降低，TNFα、IL-1β的含量均显著降低，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

图2 抑制miR-143-3p的LPS诱导的牙周膜细胞凋亡图

表2 抑制miR-143-3p对LPS诱导的牙周膜细胞炎症、凋亡的影响

2.3 miR-143-3p靶向SIRT2 Starbase靶点预测网站发现，SIRT2与miR-143-3p之间存在连续的靶向结合位点，如图3A。双荧光素酶报告基因检测实验结果如图3B所示，agomiR-143-3p组SIRT2-WT细胞的荧光活性显著的低于agomiR-143-3p 组SIRT2-MUT 细 胞、agomiRNA 组SIRT2-WT、SIRT2-MUT细胞（P＜0.05）；与agomiRNA组相比，agomiR-143-3p组SIRT2 的mRNA和蛋白表达均显著降低，与antagomiRNA组相比，antagomiR-143-3p组SIRT2的mRNA和蛋白表达显著升高（P＜0.05），如图3C、D、E。

图3 miR-143-3p与SIRT2之间的靶向关系A：miR-143-3p与SIRT2之间存在连续的6个互补结合位点；B：双荧光素酶报告实验结果；C：miR-143-3p调控SIRT2 mRNA表达；D、E：miR-143-3p调控SIRT2蛋白表达与AgomiRNA组比较，*P＜0.05；与AntagomiRNA组比较，#P＜0.05

2.4 过表达SIRT2抑制LPS诱导的牙周膜细胞炎症、凋亡 与对照组相比，模型组细胞SIRT2蛋白表达降低，与pcDNA 组相比，pcDNA-SIRT2 组细胞SIRT2 表达升高（图4A、B），NLRP3、Caspase-1、TNFα、IL-1β、细胞凋亡率（图C）均升高（P＜0.05），见表3。

表3 过表达SIRT2对LPS诱导的牙周膜细胞炎症、凋亡的影响

图4 SIRT2蛋白图及细胞凋亡图A：SIRT2蛋白电泳图；B：SIRT2蛋白相对表达量；C：牙周膜细胞凋亡图

2.5 敲减SIRT2部分转抑制miR-143-3p对LPS诱导的牙周膜细胞炎症、凋亡的作用 结果如表4和图5 所示，与antagomiR-143-3p+si-NC 组相比，antagomiR-143-3p+si-SIRT2组miR-143-3p表达显著升高，NLRP3、Caspase-1的mRNA表达均显著升高，TNFα、IL-1β的含量均显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。

表4 敲减SIRT2部分逆转抑制miR-143-3p的抗LPS诱导的牙周膜细胞炎症、凋亡作用

图5 敲减SIRT2联合抑制miR-143-3p的LPS诱导牙周膜细胞凋亡图

3.讨论

miR-143参与心血管疾病、神经系统疾病及自身免疫性疾病的发展过程[8-10]。随着医疗技术、科研水平的不断提升，其在其他疾病中的功能逐渐被发掘。Wang等[11]发现，过表达miR-143-3p抑制人牙周膜细胞的成骨分化和矿化，这与其靶向KLF5抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性紧密相关。Dong等[12]发现，miR-143-3p在LPS诱导的PDLCs中升高，抑制miR-143-3p削弱LPS对PDLCs细胞增殖的抑制、凋亡促进和炎症反应，抑制AKT/IKK通路活性，并且MEG3为miR-143-3p的上游调控因子，揭示MEG3通过下调miR-143-3p失活AKT/IKK通路，从而抑制LPS诱导的PDLCs损伤。在本研究中，miR-143-3p在LPS诱导hPDLCs细胞中表达升高，且抑制miR-143-3p明显的减弱了LPS对hPDLCs细胞NLRP3、Caspase-1、TNFα、IL-1β及细胞凋亡的促进作用，发挥保护作用。这也说明miR-143-3p在牙周炎中扮演致病作用。这与前人关于miR-143-3p在牙周疾病中的研究结果相吻合。深入研究发现，miR-143-3p靶向负调控SIRT2，于是推测SIRT2可能参与了miR-143-3p在牙周炎中的致病作用。

Sirtuins是NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，在哺乳动物中，存在7种亚型SIRT1-SIRT7，其中SIRT1和SIRT3研究最为广泛，而SIRT2是新的研究焦点[13]。Zheng等[14]报道，烟酰胺通过上调miR-22-3p诱导PDLSC增殖和分化，SIRT1作为miR-22-3p的下游靶点之一，调控PDLSC细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表达水平。Pérola报道[15]，在牙周炎患者的治疗过程中，血清SIRT1的表达从（1.06±1.03）至（1.66±1.64）ng/mL，血清甘露糖结合凝集素（MBL）、C 反应蛋白的浓度均发生降低，这暗示SIRT1对牙周炎患者的潜在保护作用。近期，Chen及其团队[16]研究发现NLRP3可以在巨噬细胞中被去乙酰化酶sirtuin 2（SIRT 2）去乙酰化，导致产生IL-1β的能力减弱，推测SIRT2抑制NLRP3炎症小体的活性。有研究报道，SIRT2作为细胞溶质NAD依赖性脱乙酰酶，可通过自主抑制造血干细胞（HSC）中NLRP3炎性小体的激活，用于维持老年HSC及再生。随着年龄的增长，SIRT2表达的降低和线粒体应激的增加导致HSC 中NLRP3 炎症小体的异常激活。SIRT2过度表达、NLRP3失活或Caspase-1失活可改善老化HSC的维持和再生能力[17]。此研究结果显示，SIRT2 低表达，而过表达SIRT2 抑制了LPS 对hPDLCs 细胞炎症、凋亡的促进，减轻了LPS 诱导hPDLCs损伤。深入研究发现，敲减SIRT2明显的削弱了抑制miR-143-3p对受损hPDLCs细胞的保护作用。

综上所述，miR-143-3p 加重LPS 诱导的hPDLCs细胞发生炎症和凋亡，这种致病作用的潜在机制与SIRT2有联系，为牙周炎的治疗提供新思路。