溃疡性结肠炎动物模型研究进展

胡 宇, 兰昀羲, 陈晓晓, 熊 伟, 唐宋琪, 贾 波, 黄 巍

(1. 成都中医药大学,成都 611137; 2. 成都岐黄博恩生物科技有限公司,成都 611139; 3. 海南医学院,海口 571199)

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明，波及结肠与直肠的慢性、特发性炎性肠病［1］。据世界胃肠病学组织描述，UC 在30～70 岁人群中发病率基本稳定，性别间发病率也基本持平。但从整体人群而言，该病在世界范围内发病率正在不断上升，在我国等新兴工业化国家和地区这一表现更为显著［2］。虽有大量研究证明UC 是由遗传、饮食等危险因素诱发的宿主异常免疫反应导致的一种炎性肠病，但目前对于其发病机制仍然缺乏全面的认识。因此，仍需要更多的动物实验研究来深入探讨UC 发生发展机制。

迄今为止，UC 动物模型造模方法较多、机制各异［3］，并且缺乏标准统一的评价指标。虽然已有文献对UC动物模型进行了一定的综述，但多集中在对不同动物模型的介绍及原理阐述方面，往往忽略了具体造模方法的整合与对比，对于研究者选择动物模型时的参考意义有限。同时，评价指标的选取是检验动物模型有效性的必要依据，对于评价指标体系的总结尚未完善。因此，本文通过对现有UC模型动物的选择、动物模型的建立方法以及评价指标的选取进行文献综述，以期为UC动物实验中模型选取提供较为全面的参考依据，同时为动物模型和评价指标的优化提供理论基础。

1 造模方法及模型动物的选取

UC的主要特征表现为结肠及直肠长期反复发作的慢性炎性反应，其发病机制与机体免疫系统的紊乱和异常的免疫反应密切相关［4］。因此，通过药物对动物肠道产生一定的化学刺激或直接损伤，模拟肠道局部的炎性反应损伤，是目前UC动物模型最常用的造模方法［5］。除此以外，通过异体抗原诱发动物肠道的异常免疫反应，也是较为常用的造模方法。而得益于基因组学的进步和技术发展，基因工程技术诱导动物出现自发性结肠炎也成为现今动物模型发展的重要趋势。

1.1 化学药物、异体抗原或二者联合使用

化学药物诱导是最经典且最为常用的UC动物模型建立方法。可用于诱导动物UC 的化学药物种类较多［6］。葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）、2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）、噁唑酮（oxazolone，OXA）以及乙酸是最为常用的化学诱导药物，而2，4-二硝基氯苯、甲醛等药物同样也在不同研究中被选用。由于自身的化学特性，不同药物对于动物UC 的诱导机制、病理改变、恢复情况不尽相同。

DSS 诱导的动物模型具有造模方法简单的特点，只需将一定浓度的DSS 溶液予以动物自由饮用便可成功诱发动物结肠炎性反应，且研究者可根据实验需求选择合适的药物浓度及给药时间。DSS 可破坏动物结肠上皮细胞，损害上皮屏障功能，使肠腔中炎性物质入侵固有层及黏膜下层，以诱发动物异常的免疫反应［7］。但DSS 所诱导的动物结肠炎性反应多为急性表现，炎性反应在停药8～9 d后便可恢复［8］，这可能对开展常规研究造成一定的局限性。而在DSS 长期给药后，动物又可能出现结肠上皮萎缩，增加癌症的发生率，因此其慢性给药诱发的动物模型更适用于UC相关性结直肠癌的评价和研究。

TNBS作为一种半抗原，在给药时往往需要同一定浓度的乙醇溶液相混合，再通过灌肠给药。乙醇可直接对动物黏膜屏障造成破坏，而TNBS通过与大分子物质结合形成全抗原诱导免疫反应，导致促炎细胞因子释放，诱发局部炎性反应［9］。在TNBS和乙醇的共同作用下，动物结肠炎性反应由急性炎性反应向慢性炎性反应转变，更接近于人类UC的临床表现［10］。但TNBS所诱导的动物免疫反应以Th1/Th17 反应为主，被认为更接近于克罗恩病［11］。因此，TNBS 所诱导的动物模型是否能够代表人类UC的发病机制仍然存在争议。

OXA 与TNBS 同为半抗原药物，同样需与乙醇联用。但与TNBS不同，OXA可诱发动物Th2细胞介导的免疫反应，这与人类UC 发病机制更加接近［12］。但在造模时动物的高死亡率［13］及病变明显的自限性导致其并未成为最广泛使用的造模药物。

乙酸所诱导的动物模型虽然具有操作简单、成本低廉等优势，但其诱发的动物结肠炎性反应与单纯性结肠急性炎性反应更相似［14］，因此乙酸在对人类UC发病机制、潜力药物机制评估等方面研究并不具备优势。

化学药物诱导的UC 动物模型经过较长时间的发展，造模方法已相对成熟，且具有方法简单、操作简便、重复性强和价格低廉的特点，因此也成为目前最广泛使用的UC动物模型。但同时，也有学者认为单纯使用化学药物诱导的动物结肠炎性反应多为急性发作，不符合人类UC病程长、慢性发作的特点，不适合应用于慢性疾病的研究［15］。异体抗原多采用其他动物的结肠组织以对造模动物致敏而诱发其免疫功能紊乱，在此基础上通过化学药物刺激肠道局部进一步导致动物异常炎性反应，该方法既可模拟人类UC免疫紊乱的特点，又可体现急性结肠炎的病理改变，被认为更具有人类UC 的代表性［8］。因此，化学药物与异体抗原联合诱导的动物模型得以发展。但由于该方法需对模型动物进行前期致敏，造模方法较复杂，实验周期较长，且后期实验过程中动物死亡率较高［14］，不可避免对实验的正常开展造成一定影响。

在具体的实验动物选择方面，大鼠及小鼠是较为常用的UC 造模动物。大鼠的常用品种SD 大鼠与Wistar 大鼠，在不同化学药物或异体抗原等诱导下皆可出现结肠炎症，且结肠黏膜肌层、杯状细胞丢失，隐窝形态不规则、排列紊乱以及溃疡面深达肌层等病理改变也与人类UC 较为接近［15］，因此是较为常用的实验动物。常见的大鼠UC动物模型造模方法［7-9，15-29］见表1。

表1 常见的大鼠溃疡性结肠炎模型造模方法及评价指标Table 1 The modeling methods and evaluation indicators of ulcerative colitis models in rats

同实验大鼠一致，不同品种品系的小鼠亦可在化学药物的诱导下出现实验性结肠炎。但是不同品系小鼠对化学药物的易感性存在争议。有学者发现在相同浓度的DSS 自由饮用5 d 后，C57BL/6 小鼠表现出实验性肠炎的病理改变，BALB/c小鼠的病理改变则已恢复，这提示不同品系小鼠对DSS 的易感性可能不同［30］。此外，与大鼠相比，小鼠生命力较为脆弱，故在面对使用TNBS造模时所需的长期侵入式操作，小鼠耐受力较大鼠更弱，死亡率也更高。因此，在使用化学药物或异体抗原进行UC动物模型诱发时，大鼠是更为常用和推荐的实验动物。但迅速发展的基因工程技术与较完善的小鼠全基因组测序数据使得基因敲除所诱发的小鼠UC越发成为研究者首要选择的模型。常见的小鼠UC模型造模方法［31-44］见表2。

表2 常见的小鼠溃疡性结肠炎模型造模方法及评价指标Table 2 The modeling methods and evaluation indicators of ulcerative colitis models in mice

除了大鼠、小鼠外，也有学者使用猕猴［45］、实验兔［46-47］，甚至斑马鱼［48］来诱发实验性结肠炎（表3）。但受实验成本控制、造模技术成熟度等因素影响，上述实验动物仅被少数研究者用于UC 的造模，其是否能够成为具有研究意义的动物模型仍需进一步探索。

表3 其他动物溃疡性结肠炎造模方法与评价指标Table 3 The modeling methods and evaluation indicators of ulcerative colitis models in the other animals

1.2 基因敲除

随着基因工程技术的深入研究与发展，基因敲除或转基因诱导已成为一类重要的UC 动物模型建立方法。黏蛋白2（mucin 2，Muc2）由杯状细胞分泌，是产生黏液、构成上皮屏障的重要蛋白。通过将Muc2基因敲除，导致上皮屏障缺陷，可成功诱发小鼠自发性结肠炎［49-50］。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是经典的促炎细胞因子，其缺失可能导致小鼠白细胞介素（interleukin，IL）-1β 大量增加，再加之Muc2缺失诱发小鼠上皮屏障受损，可以自发诱导实验性结肠炎［30］。IL-10 本身是一个重要的抗炎细胞因子，而小鼠IL-10基因缺失可以引起IL-10抗炎作用丧失，进一步导致结肠单核吞噬细胞介导的免疫反应，由此引发结肠炎［51］。此外，IL-10 除了作为抗炎细胞因子，还可抑制内质网应激，促进肠道黏液产生。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，Nox1）可调控结肠杯状细胞及吸收细胞间平衡，且Nox1表达水平与肠道黏液厚度呈正相关。对小鼠IL-10 和Nox1 基因双敲除则可使小鼠出现与人类UC相类似的炎性反应和组织学表现［52］。小鼠多药耐药基因1a （multidrug resistance gene 1a，MDR1a） 表 达 与UC 密 切 相 关。MDR1a缺失会导致上皮屏障缺陷，进一步引起肠道微生物群相关产物积累，从而诱发T 细胞亢进并识别抗原，产生免疫反应［53］。

上述研究往往以被证实与UC 发病密切相关的蛋白、因子或相关通路介质为靶点，将实验动物目标基因进行敲除，以诱导动物自发出现结肠炎性反应，因此基因敲除的动物模型适用于对关键基因导致发病机制的研究［54］。但也正因如此，基因敲除所诱导的UC动物模型无法对疾病完整发病机制进行模拟，同时其操作方法复杂，实验费用昂贵，具有明显的局限性。

2 UC动物模型评价指标

评价指标不仅对动物模型的造模效应评估十分关键，也是研究者实验过程中必要的数据支撑。评价UC动物模型是否建立成功，目前尚缺乏标准，研究者多采用疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分、组织病理学改变及组织病理学评分，以及结肠组织肉眼评分等指标进行判断。DAI 评分以实验动物的体质量、大便性状改变及隐血作为指标，在造模前后不同时间段进行评估，最终通过评分改变以判断造模是否成功，这是在UC 动物模型建立中最常用的评价指标［9］。具体的评分方法［42，55］见表4。

表4 溃疡性结肠炎动物模型的疾病活动指数评分方法Table 4 The disease activity index (DAI) scoring method for animal models of ulcerative colitis

组织病理学改变及评分是将动物结肠组织经HE染色后，光学显微镜下观察结肠结构破坏、炎性细胞浸润等情况并进行综合评分，从而评估造模效果。这也是评价模型是否建立成功较常用的一项指标。具体评分方法［56］见表5。

表5 溃疡性结肠炎动物模型的组织病理学评分方法Table 5 The histopathological scoring method for animal models of ulcerative colitis

此外，结肠组织肉眼评分、结肠组织大体形态损伤评分［57］则是通过对实验动物结肠组织肉眼观察，以结肠粘连、局部水肿、溃疡形成及病变范围等为标准进行评估。

DAI 评分、组织病理学评分等评分方法作为评价指标被众多相关研究广泛使用，且国内外专家和学者仍在不断对具体评分细则进行完善及更新，但这也意味着目前对于评分的标准尚未得到统一。而结肠组织肉眼评分、结肠组织大体形态损伤评分则仅在肉眼观察的基础上对组织损伤程度进行评价，较组织病理学评分而言可参考度较低，因此并未成为目前主流的模型评价指标。此外，上述评分均基于实验者参照一定依据对实验动物的症状改变及病理表现进行主观评分，缺乏一定的客观性。值得注意的是，由于异常炎性反应在UC发病机制中的关键作用已被证实，关键炎性反应信号通路介导的炎性细胞、促炎细胞因子也开始成为UC 动物模型造模评价的关键指标［58］。如李霞等［26］、Catinean 等［20］将大鼠血清IL-6 水平及结肠黏膜中TNF-α表达作为指标进行检测，以评价造模是否成功。此外，IL-4、IL-8、IFN-γ 等被认为是与人类UC发生相关的细胞因子，也被不同的研究纳入作为评价指标［42-44］。但由于目前UC 的完整发病机制仍未揭示，上述炎性细胞因子是否真正是UC发生的关键，同样需要进一步证明。

由于基因敲除动物模型具有较为稳定的遗传学特征，对基因敲除或其他基因工程编辑动物模型的靶基因进行总结，有利于UC 动物模型评价指标的规范化。例如，IL-10 作为重要的抗炎细胞因子，在UC 发生期间表达降低，且缺失IL-10 可诱发小鼠出现自发性结肠炎，说明其可以作为评价UC 动物模型的潜在指标［51，59］。此外，黏液屏障是保护机体结肠免受肠道内共生微生物及潜在病原微生物定植入侵的重要防线，而分泌黏液的Muc2 蛋白缺失也是UC 患者肠道屏障失调的典型特征，因此Muc2 同样可能作为评估UC 动物模型的另一潜在指标［49-50，60］。总之，形成标准的评价指标体系，有利于UC动物实验研究的规范，而基于基因工程的UC动物模型对推进评价指标体系的发展具有明显优势。

3 结论

本文对UC 动物模型进行了文献分析，发现目前UC动物模型的建立方法较多且各有优劣。研究者在进行动物实验时需根据自身的实验目的、实验成本、实验周期、预期结果等因素进行考量，以选择相应的动物模型。同时，当下UC 动物模型仍然存在许多不足，仍然缺乏与人类UC具有高度模拟性的动物模型，而且动物模型评价系统也尚未完善。操作性强、造模成本低、模拟程度高且评价系统完善的动物模型可能成为揭示UC发病机制、探索高效治疗策略的关键工具。因此，在UC的进一步研究中，理想动物模型的探索仍需不断深入。

[作者贡献Author Contribution]

胡宇负责选题、论文检索、论文撰写；兰昀羲负责论文检索与整理；陈晓晓、熊伟负责阅读整理论文、表格汇总；唐宋琪、贾波、黄巍负责论文审阅、修改。

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所有作者均声明本文不存在利益冲突。