miR-372在非小细胞肺癌组织中表达及意义

何慧 陈军 姜兰

肺癌是我国居民发病率和死亡率均高居首位的恶性肿瘤[1]，其中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是主要的组织学类型，约占85%左右[2]。目前，NSCLC早期诊断率低，多数患者就诊时已错失最佳治疗时机，即使现有诊疗技术不断提高，但对患者预后改善依然作用有限[3]。因此，有必要寻找与NSCLC病程进展相关基因，以指导患者早期诊疗。微小RNA(microRNA，miRNA)作为仅含约20nt的短链信使RNA，可稳定存在于组织中，广泛参与调控多项生理病理过程及疾病进程[4]，研究表明[5]，肿瘤组织中存在miRNA表达异常。且参与调控了肿瘤细胞生物学功能[6]。miR-372作为miRNA家族成员，已发现其参与了前列腺癌[7]、膀胱癌[8]、结直肠癌[9]等多种肿瘤病理进展过程。本研究分析了NSCLC组织中miR-372表达，探讨其临床意义，以及上调该基因对A549细胞增殖及侵袭的影响。

资料与方法

一、资料

以2018年3月至2021年3月在我院接受治疗的NSCLC患者为对象，纳入标准：(1)初治患者，术前未接受放化疗；(2)术后病理学检查证实；(3)临床资料完整，患者或家属均知情且签订知情同意书。排除标准：(1)肝肾功能严重不全者；(2)合并有肺部急慢性疾患、免疫系统疾病者或其他系统恶性肿瘤者。共111例，男61例，女50例，年龄(57.21±9.06)岁，组织学分类：鳞癌57例，腺癌54例；分化程度：低分化35例，中-高分化76例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期66例；出现淋巴结转移38例。

二、主要试剂和仪器

Trizol总RNA提取液购自武汉纯度生物科技公司，One step RT-PCR kit购自北京索莱宝公司，miR-372和内参引物由杭州浩克生物公司涉及合成，A549细胞购自上海通派生物公司，DMEM培养液、胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，miR-372模拟序列及对照序列由上海美轩生物公司设计合成，CCK-8试剂盒购自武汉菲恩生物公司，Annexin V-FITC/PI试剂盒购自上海锐赛生物公司，Transwell小室购自美国Costar公司，基质胶和流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

三、qRT-PCR术检测NSCLC和癌旁组织中miR-372表达

取组织，剪碎、充分研磨，使用Trizol总RNA提取液分离组织中总RNA，并检测其浓度和纯度。使用One step RT-PCR kit完成对总RNA逆转录及扩增过程，引物序列(见表1)。反应条件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，74℃ 50s，循环30次。2-△△Ct法计算组织中miR-372表达量。

表1 引物序列

四、细胞培养和处理

用DMEM培养液(含10%胎牛血清)对A549细胞培养，条件：5% CO2、37℃。将对数生长期细胞用胰酶消化后接种在6孔板，待细胞培养至融合度在85%以上时，用Lipofectamine 2000行分组转染：(1)M组：转染miR-372模拟序列：5′-CCUCAAAUGUGGAGCACUAUUCU-3′；(2)NC组：转染阴性对照：5′-GCUUGUGAUGGAGUAUUAUTT-3′；(3)N组：仅加入等量转染试剂。处理后培养48h。

五、qRT-PCR术检测细胞中miR-372表达

取处理后的细胞，加入细胞裂解液，其余步骤按1.3操作。

六、CCK-8实验

取处理后的细胞，消化后接种在96孔板，数量2×104/孔，恒温箱中培养，分别在12、24、48、72和96h时，向各孔加入CCK-8液10μL，孵育2h，用酶标仪检测各孔光密度值(OD值)，重复实验3次。

七、Annexin V-FITC/PI染色

取各组处理后48h细胞，离心取沉淀，用预冷PBS冲洗3次，取约2×105个细胞，用200μL的1×Binding Buffer重悬，加入5μL的Annexin V-FITC，摇匀，加入5μL的PI，避光反应12min，用流式细胞仪检测。

八、Transwell实验

用无血清培养液对基质胶按1:6稀释，平铺在小室膜，放干。用胰酶将各组处理后细胞消化后，离心取细胞沉淀，加入无血清培养液制备2.5×104/mL的悬液，取200μL放到上室，取完全培养液600μL加到下室，培养24h，取出小室，弃培养液，去除上室散落细胞，固定，1%结晶紫染色15min，倒置显微镜下观察并计数。

九、统计学分析

结 果

一、NSCLC和癌旁组织中miR-372表达量比较

NSCLC和癌旁组织中miR-372表达量分别为(0.31±0.10)和(1.02±0.11)，差异有统计学意义(t=50.031，P<0.001)。

二、不同临床指标NSCLC组织中miR-372表达量比较

不同年龄、性别、吸烟史、肿瘤直径、组织学分类的NSCLC组织中miR-372表达量无差异(P>0.05)，低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和发生淋巴结转移的NSCLC组织中miR-372表达量明显低于中-高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未发生淋巴结转移的NSCLC，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 miR-372在不同临床指标NSCLC组织中表达量比较

三、细胞中miR-372表达

M组、NC组和N组细胞中miR-372表达量分别为2.69±0.18、1.02±0.12和1.03±0.10，差异有统计学意义(F=292.777，P<0.001)；M组细胞中miR-372表达量高于NC组和N组，差异有统计学意义(P<0.05)。

四、细胞增殖能力

M组24、48、72和96h时细胞OD值低于NC组和N组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 CCK-8实验检测细胞增殖能力(OD值，

五、细胞凋亡情况

M组、NC组和N组细胞凋亡率分别为(32.27±3.58)%、(17.83±4.69)%和(16.09±3.01)%，差异有统计学意义(F=32.347，P<0.001)，M组细胞凋亡率高于NC组和N组，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

图1 流式细胞术检测细胞凋亡情况(A：M组，B：NC组，C：N组)

六、细胞侵袭能力

M组、NC组和N组侵袭细胞数分别为(89.17±6.40)个、(131.17±10.48)个和(134.83±9.04)个，差异有统计学意义(F=49.758，P<0.001)；M组侵袭细胞数低于NC组和N组，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 Transwell法检测细胞侵袭能力(A：M组，B：NC组，C：N组，结晶紫×200)

讨 论

目前，随着手术及术后辅助治疗手段的不断进步，显著提高改善了NSCLC患者预后，延长了患者生存时间[10]，但高复发和转移特性仍是影响治疗效果的重要因素，严重影响了患者治疗后生存率[11]。因此，从分子生物学角度明确与NSCLC复发、转移相关机制，寻找敏感基因，对提高患者诊疗效果意义深远。研究发现[12]，miRNA差异性表达与肺癌发生及进展密切相关。而且参与调控了肺癌侵袭和转移网络[13]。有研究指出[14]，miR-372参与调节了膀胱癌的转移。Xu等[15]指出，MiR-372-3p通过靶向FXYD6抑制骨肉瘤细胞的生长和转移。亦有研究指出[16]，MicroRNA-372通过激活PBK依赖性p53信号通路，增强放射敏感性同时抑制鼻咽癌细胞侵袭和转移。本研究结果表明，miR-372在NSCLC组织中呈低表达，可能在NSCLC发病中起抑癌基因的作用。本研究结果显示，miR-372在低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和发生淋巴结转移的NSCLC组织中表达显著降低，说明miR-372低表达可能参与了NSCLC恶性化病程进展。

为进一步明确miR-372在NSCLC进程中的作用，采用转染模拟物的方式提高A549细胞中miR-372表达，结果显示，M组细胞中miR-372表达量高于NC组和N组，说明转染模拟物后，A549细胞中miR-372表达量显著升高。本研究结果显示，M组24、48、72和96h时细胞OD值低于NC组和N组，说明升高A549细胞中miR-372表达量可明显抑制细胞增殖活力。本研究结果显示，M组细胞凋亡率低于NC组和N组，说明升高A549细胞中miR-372表达量可加速细胞凋亡。由此推测，升高miR-372表达可能通过降低细胞增殖，加速细胞凋亡而在抑制肺癌进程中发挥作用。Transwell实验进一步表明，升高miR-372表达可明显降低A549细胞侵袭能力。

综上所述，miR-372在NSCLC组织中呈低表达，可能在NSCLC恶性化进程中发挥抑癌基因的作用，升高A549细胞中miR-372表达，可抑制细胞增殖并加速细胞凋亡，降低细胞侵袭力，但其具体发挥作用的分子机制及可能涉及的信号通路有待开展进一步的研究予以明确。