川芎嗪通过调控mTOR的表达减轻细菌脂多糖诱导的脐静脉内皮细胞内皮屏障破坏

高可飞 刘小碣 丁渡山 闵思敏 李言 张永

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)可并发肺不张和ARDS(急性呼吸窘迫综合征)[1-2]，给我国造成了巨大的经济负担。ALI关键的病理特征是肺血管内皮屏障完整性的破坏[3-4]。因此，靶向保护血管内皮屏障的完整性可能是治疗ALI的新方向。川芎嗪(TMP)是从植物川芎中提取的一种活性物质，可抑制炎症，在ALI的治疗中发挥着重要作用[5-7]，但是具体的治疗机制尚不清楚。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)属于PI3K(一种胞内磷脂酰肌醇激酶)相关激酶家族，在急性肺损伤中发挥着重要调控作用[8],并可促使细胞骨架破坏[9-10]。然而，目前对于mTOR在ALI中内皮通透性的研究较少。本研究采用LPS刺激的细胞模型，研究川芎嗪对于LPS诱导的HUVEC细胞骨架和内皮细胞通透性的作用，并探寻可能的作用机制。

资料与方法

一、材料

1 脐静脉内皮细胞获取

蚌埠医学院第一附属医院手术室取健康产妇足月剖宫产脐带(标本获取经过蚌埠医学院伦理委员会批准，批号：伦动科批字[2016]第015号)，放入保存液(M199培养基配制)冷藏至实验室。无菌条件下PBS和预冷酒精冲洗脐带表面。再用37℃预热的PBS冲洗脐静脉血管，直到下端流出液体澄清。注入Ⅰ型胶原酶进行内皮细胞消化，放入装有预热PBS的无菌瓶子中，一起放入37℃水浴锅中不断翻动、震荡消化5～10分钟。将消化好的液体放入离心管中，再用ECM培养基进行冲洗2遍。1000转离心10分钟。弃上清，用ECM培养基重悬细胞沉淀，种于培养瓶(皿)中，37℃，5% CO2培养箱中培养。

2 试剂

磷酸川芎嗪(中国药品生物制品鉴定所)；LPS及FITC标记的葡聚糖(Sigama)；ECM培养基(ScienCell)；M199、胰酶细胞消化液、DAPI(Biosharp)；PMSF和RIPA裂解液、4%多聚甲醛(碧云天)；transwell培养板(LABSELECT)；VWF抗体、抗荧光淬灭剂(博士德)；p-mTOR(CST)、mTOR(CST)、viculin(proteintech)；磷酸酶抑制剂(Roche)；FITC标记的鬼笔环肽(索莱宝)；CY3标记的荧光二抗(Jackson)。

二、方法

1 内皮细胞鉴定

细胞用胰酶消化后，重悬制成细胞悬液。滴加于细胞爬片上。放入37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。第二天用DMEM培养基清洗1次。然后加入预冷的4%多聚甲醛固定细胞。PBS清洗3次。加入0.5%TritonX-100 穿孔。PBS清洗3次。滴加VWF相关抗原抗体4℃孵育过夜。第二天吸出抗体，PBS清洗3次。滴加稀释好的荧光二抗CY3抗体，孵育2小时。PBS清洗3次。吸干PBS，取出爬片，滴加抗荧光淬灭剂于载玻片并将爬片放入，指甲油外周封片。蔡司荧光显微镜上拍照。

2 分组

将培养好的细胞按照加药处理的不同分为空白对照组、LPS组(LPS刺激12 h，浓度为400ng/μL)、TMP(TMP预保护12 h后加LPS刺激12 h，浓度为60μg/mL)+LPS组。

3 免疫荧光

(1)将细胞用消化计数后制成细胞悬液。滴于细胞爬片上。放入37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。(2)第二天加药处理(LPS、TMP)。(3)用DMEM培养基进行清洗1次，然后加入预冷的4%多聚甲醛固定。PBS清洗3次。(4)加入0.5%TritonX-100穿孔。PBS清洗3次。(5)避光滴加FITC标记的鬼笔环肽，避光孵育30分钟PBS清洗3次。(6)滴加DAPI避光孵育3分钟，PBS冲洗5次。吸干PBS。(7)取出爬片，放入滴加有抗荧光淬灭剂载玻片上。指甲油外周封片。蔡司荧光显微镜上拍照。

4 跨内皮电阻实验

将细胞消化计数后，种于含有Transwell小室的24孔板，测基础电阻值(含培养液)，并12小时测电阻一次。待电阻值达到平台期加药(LPS、TMP)处理,检测加药后12小时电阻值。TEER 值按以下公式计算：TEER 值(单位:Ω×cm2)=(内皮细胞电阻值-基础电阻)×Transwell 上室滤膜的底面积(0.33 cm2)。

5 细胞通透性实验

将细胞消化计数后，种于含有transwell小室(底面积0.33cm2)的24孔板，达到70%融合度时加药处理(LPS、TMP)。处理结束后，吸出原有培养基。将下室更换为不含血清的ECM培养基600μl，上室加入FITC标记的葡聚糖溶液(500 μg/mL)200 μL。在 37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育 1 h 后，从每个嵌套小室上层和下层分别取液 100 uL，加入黑色 96 孔板中，避光，用 Synerge II 多功能酶标仪测定 Transwell 小室上下双层液体中的荧光强度值，激发光波长 485nm，发射光波长 528 nm。内皮细胞单层对葡聚糖通透性的大小用通透系数 Pa 表示，Pa 计算公式：Pa=[A]/t×1/A×V/[L]

注：[A]为下室荧光强度值；t为FITC—葡聚糖孵育时间(单位：秒)；A为小室滤膜面积(单位：cm2)；V为下室液体量；[L]为上室荧光强度值。实验结果以Pa%表示。Pa%=(实验样品组Pa/实验对照组 Pa)×100%

6 蛋白印迹法(westernblot)

将提取好的蛋白，用BCA方法测定浓度。制好胶后加入各组蛋白样品，90v浓缩胶电泳，到分离胶之后更换为120v电泳至到底部。将电泳好的胶进行转膜，将PVDF膜贴于目的条带处，采用三明治方法转膜。BSA封闭，一抗4℃孵育过夜。第二天TBST洗膜三次后，孵育对应种属的二抗2小时。洗膜3次后，显影仪上曝光。

7 荧光定量PCR(qPCR)

细胞RNA提取操作应用试剂盒(诺唯赞RNA提取试剂盒)方法提取，严格按照说明书操作，提取完毕应用酶标仪检测A260/280吸光度，确定RNA的纯度及浓度。然后进行逆转录及qPCR(应用诺唯赞试剂盒)。qPCR引物序列为mTOR：Forward Primer GCAGATTTGCCAACTATCTTCGG，Reverse Primer CAGCGGTAAAAGTGTCCCCTG。按照试剂盒说明书配制体系，上机进行检测。

三、统计学方法

结 果

一、应用VWF抗体(Ⅷ因子抗体)进行脐静脉内皮细胞鉴定，结果(见图1)。内皮细胞呈现红色。

图1 脐静脉内皮细胞鉴定(200×，标尺50 μm)

二、TMP可减少LPS诱导的脐静脉内皮细胞应力纤维的形成。

三组免疫荧光细胞骨架染色结果表明，LPS组较空白对照组应力纤维明显增粗、增多，加入TMP治疗后应力纤维较LPS组明显减少、变细(见图2)。

图2 三组免疫荧光细胞骨架趋势(200×，标尺：50 μm)

三、TMP可部分逆转LPS诱导的脐静脉内皮细胞TEER值的降低

种入细胞后，TEER值随时间增长呈现明显增加趋势，尤其于36～48小时增加最明显。于48～60小时达到平台期(见图3)。于平台期加药处理后，结果表明加药0小时三组电阻值差异未到达统计学意义(F=3.233,P=0.112>0.05)，而加药处理12小时后，LPS组跨膜电阻值较空白组明显降低(t=16.49，P<0.001,)，而TMP治疗组较LPS组跨膜电阻值明显增加(t=7.924，P=0.001)(见图4)。

图3 种入细胞后TEER值随时间变化图

图4 加入LPS和TMP处理后各组电阻值变化趋势图

四、TMP可减轻LPS诱导的内皮细胞通透性增加

LPS组通透系数较对照组明显增加(t=18.26，P<0.001)，而TMP治疗组通透系数较LPS组降低(t=6.834，P=0.002)(见图5)。

图5 三组细胞通透性结果比较

五、TMP对LPS诱导的mTOR水平变化的影响

应用荧光定量PCR技术，检测mTOR的相对表达水平，结果发现LPS组较对照组mTOR表达量明显增加(t=7.684，P=0.002)，而TMP治疗组mTOR表达量下降(t=3.069，P=0.040)(见图6)。

图6 三组qRCR mTOR相对表达量的差异

蛋白印迹法(westernblot)(如图7、8)所示：应用蛋白印迹法检测三组mTOR和p-mTOR的表达量，结果表明LPS组较对照组p-mTOR/mTOR较明显上升(t=2.841，P=0.047<0.05)，而TMP治疗组较LPS组则有明显下降。(t=2.804，P=0.049<0.05)

图7 三组Westernblot条带图

讨 论

Webel ER等在上世界60年代首次发现血管内皮细胞胞浆中存在杆状和管状的物质，80年代Jaffe进一步研究认为 VWF相关抗原免疫荧光检测最为可靠 ,因为在人体内，除内皮细胞外,仅在血小板和巨核细胞中存在VWF因子相关抗原 ,故可与血管平滑肌和成纤维细胞相鉴别。目前常应用Ⅷ因子作为内皮细胞鉴定标志物，这可能是由于Ⅷ因子可特异性沉积于Weibel-Palade小体，而Weibel-Palade小体是内皮细胞所特有的杆状细胞器。本研究采用Ⅷ因子抗体对分离的人脐带血管内皮细胞进行鉴定，结果与报道的一致。

图8 三组Westernblot条带对应统计图

细胞骨架由相互连接的细丝状结构组成，主要包括:肌动蛋白微丝、微管和中间细丝。为细胞提供结构支持并维持多细胞组织的稳定。细胞骨架对于维持细胞形态和细胞内物质运输、细胞器的移动起着不可替代的作用。肌动蛋白细胞骨架，是一种高度动态的结构，在调节内皮细胞连接的稳定性和血管通透性方面起着至关重要的作用。研究证明内皮屏障的完整性依赖于体内肌动蛋白的形态[11]。应力纤维被认为增加向心张力，因此可能介导细胞-细胞边界收缩，有利于细胞旁间隙的形成[12]。炎症介质及通透性增加药物等物质，可诱导内皮细胞屏障破坏和肌动蛋白应力纤维的形成，最终导致内皮细胞骨架的促收缩变化和细胞间隙增大，包括Rho信号的激活导致肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的抑制，随后是肌球蛋白轻链磷酸化的增加、收缩的启动和细胞旁通透途径的开放。内皮细胞高通透性是肺损伤的一个重要病理过程，并可导致不良结局。细胞间粘附和细胞骨架收缩力之间的不平衡会导致内皮细胞通透性过高，因此，内皮屏障的调节依赖于细胞骨架的重新排列[4]。LPS作为一种炎症介质可增加细胞通透性、应力纤维形成、肌动蛋白收缩和细胞旁间隙形成[13-14]。本研究发现加入LPS刺激后可诱导HUVEC应力纤维增加，并明显增粗。与之前报道的一致。而经过川芎嗪治疗后应力纤维较LPS刺激组则变细、减少。进一步说明TMP治疗，可逆转LPS诱导的ALI所造成的细胞骨架破坏，并且起到对细胞和内皮屏障保护作用。

血管内皮细胞形成半通透性屏障隔开血液与组织，并可允许特定的物质进行跨膜转运，发挥正常的生理过程。内皮连接分离，是细胞受到炎症介质刺激导致的细胞屏障功能障碍的主要标志。本研究结果表明，LPS刺激后HUVEC细胞通透系数明显增加，而应用TMP治疗后通透系数较LPS组则明显下降，表明TMP可通过降低细胞通透性来保护LPS诱导的ALI。虽然异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖不能用来动态监测细胞屏障的完整性。但跨上皮/跨内皮电阻(TEER)是跨单层细胞电阻的测量，是确认单层细胞完整性和通透性的非常敏感和可靠的方法，其可用来监测细胞的增殖和生长状况[15]。本研究中，种入HUVEC细胞后随着时间的增长，TEER值呈上升趋势，36～48小时TEER增长迅速，于48小时达到平台期。然而加入LPS后，TEER值较空白对照组明显降低[16]，而经过TMP治疗后，TEER值较LPS组明显有所升高。与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖结果一致，LPS可诱导单层内皮细胞通透性及TEER值变化，导致细胞屏障的破坏。单层细胞TEER值随着细胞数量的增加而增加，直到达到平台期，而TEER的显著降低证明了内皮屏障系统的完整性遭到破坏[17]。因此，TMP不仅可保护细胞骨架的完整性,而且还可通过降低内皮细胞通透性来进一步治疗ALI。

近年来研究发现mTOR信号通路不仅在肿瘤性疾病的发生、发展以及治疗上发挥重要的作用[18-20]，而且在ALI的治疗上也发挥着举足轻重的作用[8,21-22]。Wu[21]等人研究发现通过抑制mTOR活性可以促使支气管上皮和小鼠气道上皮细胞的自噬活性增加，进一步削弱溶酶体的活性，从而引起肺损伤的产生。Li等[23]还发现PI3K/Akt/mTOR通路还可诱导肺DCs(树突状细胞)的成熟和增强其抗原提呈能力，显著升高髓系DCs，增强肺DCs的粘附和趋化能力，最终对肺损伤的保护作用。这些研究表明mTOR信号通路的激活可能对肺损伤起着重要的保护作用。然而，还有一些研究表明mTOR信号通路活性的激活可能加重ALI的发生发展[24-26]。不仅如此，F-肌动蛋白细胞骨架的重排，涉及多种蛋白激酶信号通路，包括哺乳动物靶点雷帕霉素(mTOR)。最近研究表明IGF-1激活mTOR通路，可调节F-肌动蛋白的细胞骨架组织[27]。因此，mTOR蛋白在细胞骨架和肺损伤中发挥关键的调控作用。另外，本课题组前期已经证实TMP可通过Rac1/LIMK1信号通路来保护LPS诱导的HUVEC细胞的损伤[28]，mTOR作为Rac1/LIMK1信号通路的上游蛋白，可能在调节细胞骨架及维持内皮屏障的完整性中也起着重要作用。本研究中利用western blot技术检测了三组mTOR和p-mTOR的表达量并应用qPCR技术检测其mRNA的表达水平，结果发现LPS组较对照组p-mTOR/mTOR明显上升，TMP治疗后则有明显下降，这与文献报道的一致[29]，这可能是由于LPS刺激后增加了炎症细胞浸润和抑制自噬所造成。本研究的结果表明LPS可使mTOR表达变化，mTOR蛋白变化可能导致细胞骨架重排，应力纤维形成增加，进一步导致细胞-细胞连接分离和细胞旁间隙增加、细胞屏障破坏，渗透性增加，从而最终加重肺损伤的发生。这与之前报道的mTOR激活加重肺损伤的结果相一致。这表明mTOR可能参与了HUVEC损伤的发生，并且引起其病理上细胞骨架的破坏、TEER异常下降和单层细胞通透系数的明显增加，最终使细胞和组织水肿、坏死，引起不良结局。

本研究未进行动物模型来验证其可靠性，这是其局限性。但是将来我们将通过动物实验来模拟体内环境进一步验证以上结果的准确性。

总之，本研究的结果说明TMP治疗可减少LPS引起的内皮细胞mTOR表达及细胞骨架应力纤维增粗增多，不仅如此，TMP还可逆转LPS导致的内皮细胞单层细胞通透性增加和TEER降低。因此，TMP可通过抑制mTOR的表达量，在LPS诱导引起的内皮细胞屏障功能障碍中起着重要的保护作用，其可作为治疗急性肺损伤的一个重要靶点。