不同软糖基质中甲钴胺含量的检测

余 斐，李伟佳，张敬锴，林岱滨，李欣纯

（广东亿超生物科技有限公司，广东汕头 515000）

维生素B12又称钴胺素，是唯一的一种需要肠道内分泌物（内因子）帮助才能吸收的维生素，其家族成员主要包括氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺[1]。甲钴胺作为维生素B12在体内的活性形式之一，其对外神经组织具有良好的传递性，可促进核酸-蛋白-脂肪的代谢，可修复损伤的神经组织[2]。维生素B12是人体必需且不能自身合成的重要营养物质，可从食物中获取。贫血和脊髓亚急性联合变性是维生素B12缺乏引起的典型表现，维生素B12缺乏也可引起不自主运动、视力下降、癫痫、认知情感障碍、自主神经功能障碍及皮肤色素沉着等不典型表现[3]。

甲钴胺作为维生素B12来源添加到软糖膳食补充剂中的研究较少。软糖目前主流的基质有明胶和果胶两种，现采用HPLC法测定不同软糖基质中甲钴胺含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260高效液相色谱仪；甲钴胺对照品（93.9%），中国食品药品检定研究院，批号100692-202006；磷酸二氢钾（色谱纯），科密欧，含量≥99.50%；氢氧化钠（分析纯），光华科技，含量≥85.0%；磷酸（色谱纯），美国天地，含量≥85.0%；乙腈（色谱纯），美国天地，含量≥99.90%。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：月 旭UItimate AQ-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液 （用0.2 mol/L氢氧化钠溶液或磷酸调节pH值至4.5）-乙腈（84∶16）；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：342 nm；进样量：10 μL。

1.3 供试品溶液的制备

称取5.0 g供试品于50 mL具塞塑料离心管中，60 ℃水浴溶解，回室温后加水定容至50 mL， 10000 r/min离心2 min。上清液经0.45 μm滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液。

1.4 标准曲线的制备

准确称取100 mg甲钴胺标准品加水溶解定容，配制成浓度为2.0 mg/mL的甲钴胺标准储备溶液，棕色瓶保存。分别吸取一定体积的甲钴胺标准储备溶液，加水稀释，制备一系列标准溶液，标准工作曲线溶液浓度为4 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、 80 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，按上述色谱条件采用高效液相色谱仪分析，以浓度为横坐标，以测得峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.5 测定方法

将供试品溶液按上述色谱条件进高效液相色谱仪测定，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。

2 结果与分析

2.1 方法专属性的考察

取甲钴胺阴性样品，依上述方法制备处理、检测，测定图谱如图1、图2所示。由图可知，不存在基质干扰情况，色谱条件可行。

图1 对照品色谱图

图2 甲钴胺阴性样品色谱图

2.2 溶液稳定性考察

将浓度为40 μg/mL的甲钴胺对照溶液按1.2色谱条件进行0 h、4 h、6 h和10 h溶液稳定性考察，通过峰面积的变化考察溶液稳定性。结果显示，4 h、6 h、10 h的溶液对0 h溶液的偏差分别为1.2%、0.3%、0.3%，符合溶液稳定性≤5%的要求。说明甲钴胺对照溶液在10 h内是稳定的，见表1。

表1 溶液稳定性考察结果

2.3 线性范围与检测限、定量限的测定

依1.4测定数据，拟合获得回归方程为y= 0.8907x-2.3952，R2=0.9997，表示在4～200 μg/mL浓度范围内，有良好线性。分别取甲钴胺明胶基质阴性样品和果胶基质阴性样品，加标，MDL方式测定，结果显示在供试品称样量为5 g，稀释倍数为50 mL时，测得甲钴胺在软糖明胶基质中检出限0.53 mg/kg，定量限1.77 mg/kg；甲钴胺在软糖果胶基质中检出限0.22 mg/kg，定量限0.74 mg/kg。

2.4 精密度和准确度的测定

取甲钴胺明胶基质阴性样品，分别加入一定量的甲钴胺标准品溶液，按1.3步骤操作，使之成为理论浓度分别约为5 μg/mL、45 μg/mL、110 μg/mL的样品，每个浓度平行操作6份，按照1.2的色谱条件上机测定，计算各组样品含量的RSD，结果如表2所示。试验结果显示，明胶基质阴性样品3个浓度水平的准确度分别为3.4%、2.6%、1.7%，回收率分别为93.51%～106.50%，均达到可接受标准。

表2 测定甲钴胺明胶基质阴性样品精密度和准确度

取甲钴胺果胶基质阴性样品分别加入一定量的甲钴胺标准品溶液，按1.3步骤操作，使之成为理论浓度分别加入浓度为7 μg/mL、48 μg/mL和 120 μg/mL的样品，每个浓度平行操作6份，按照1.2的色谱条件上机测定，计算各组样品含量的RSD，结果如表3所示。试验结果显示，果胶基质阴性样品3个浓度水平的准确度分别为1.2%、1.1%、0.8%，回收率101%～105%，均达到可接受标准。

表3 测定甲钴胺果胶基质阴性样品精密度和准确度

2.5 光照对软糖中甲钴胺含量的影响

根据相关文献的研究，甲钴胺对光不稳定[4-5]。因此，将标示含量为500 μg/2.5 g的甲钴在普通日光灯条件下，光照1 h、2 h、3 h，考察光照对软糖中甲钴胺含量的影响，甲钴胺降解率见表4。由表中数据可知，添加了甲钴胺的软糖，光照3 h后，降解率高达70.4%。

表4 甲钴胺软糖光照实验降解率统计

3 结论

精密度测定结果显示，甲钴胺明胶基质阴性样品3个浓度RSD在1.7%～3.4%，甲钴胺果胶基质阴性样品3个浓度RSD在0.8%～1.2%，能满足精密度≤5%的要求。准确度测定结果显示，甲钴胺明胶基质阴性样品3个浓度回收率在93.51%～106.50%，甲钴胺果胶基质阴性样品3个浓度回收率在101%～105%，能满足回收率80%～110%的要求。光照实验结果提示，针对添加了甲钴胺的软糖，需要选择具有遮光材质的包材，避免光照对甲钴胺含量的影响。