醋酸钠林格注射液与包材中抗氧剂的相容性研究

邹宇，刘杨，刘亚威，张迪，孙苓苓（辽宁省检验检测认证中心，辽宁省药品检验检测院，沈阳 110036）

醋酸钠林格注射液是一种新型的电解质平衡液，组成接近细胞外液生理比例，其含有的醋酸钠盐代谢速率快，可迅速改善微循环，纠正酸中毒[1-2]。临床上广泛用于围术期液体治疗，在安全性、有效性方面优势明显[3-5]。醋酸钠林格注射液为五层共挤输液用袋包装，直接接触药品的包材有五层共挤输液用袋、聚丙烯接口、聚丙烯组合盖，均为塑料制品。塑料药包材在生产过程中会加入抗氧剂来抑制或延缓老化降解，注射液在生产、流通、储存及使用过程中长时间与药包材接触，抗氧剂可能溶出、迁移至药液中，影响药物的理化性质和药理作用，甚至对人体具有一定的毒性[6-8]。2012年9月，我国药审中心发布了《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）》[9]，指出包装系统应与药品具有良好的相容性，即不能引入可引发安全性风险的浸出物，或引入浸出物的水平应符合安全性要求。欧洲药典中对各种塑料材料中添加剂的添加量进行了限定，并给出了检验方法[10]。有文献对不同塑料材料中的抗氧剂含量、不同注射液包材相容性进行了研究[11-20]，但未见醋酸钠林格注射液包材相容性的相关报道。

醋酸钠林格注射液的药包材中使用了抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168，本研究参考欧洲药典方法[10]和相关文献[11-20]，建立了4种抗氧剂的测定方法，并对包材和注射液进行提取、迁移试验，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），Tomy SX-700型高压灭菌锅（日本Tomy公司），BUCHI旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司），TechMate C18-STII色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京泰克美公司），Cleanert S C18-SPE固相萃取柱（600 mg/6 mL，天津Agela公司）。

1.2 试药

抗氧剂1010[四（3，5-二叔丁基-4-羟基）苯丙酸季戊四醇酯，批号：195014-201601，纯度：98.2%]、抗氧剂330 [2，2'，2''，6，6'，6''-己 烷-叔丁基-4，4'，4''-（2，4，6-三甲基-1，3，5-苯基）三亚甲基]三苯酚，批号：195007-201601，纯度：99.6%]、抗氧剂1076[β-（3，5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸十八碳醇酯，批号：195009-201601，纯度：99.5%]（中国食品药品检定研究院）；抗氧剂168[三（2，4-二叔丁基）亚磷酸苯酯，批号：172881，纯度：98.5%，LGC]；四氢呋喃、甲醇（色谱纯，Fisher）；乙腈（色谱纯，Tedia）；二氯甲烷和甲苯（分析纯，国药集团）。

醋酸钠林格注射液（规格：500 mL，批号：B19041901，B19041902，B19041903，A公司），五层共挤输液用袋（批号：2001680853，2001680898，2001680930，B公司），聚丙烯接口（批号：1809151）、聚丙烯组合盖（批号：1811012）（C公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用TechMate C18-STII（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为水-四氢呋喃-乙腈（1∶3∶6），流速为1.5 mL·min-1，检测波长为280 nm，柱温为40℃，进样量为20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

称取抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂168、抗氧剂1076对照品适量，加入少量二氯甲烷溶解，以二氯甲烷-甲醇（3∶7）稀释至含抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂168、抗氧剂1076各约0.24 mg· mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 包材提取试验供试品溶液的制备 取包材样品约2.0 g，精密称量，置于烧瓶中，加入甲苯80 mL，持续搅拌，加热回流1.5 h，冷却至60℃，在搅拌下加入甲醇120 mL，烧结玻璃过滤器滤过。用甲苯-甲醇（4∶6）混合液25 mL清洗烧瓶和滤渣，将清洗液与滤液合并，并用相同的混合溶剂稀释至250 mL。取50 mL在45℃真空蒸干，残渣用二氯甲烷-甲醇（3∶7）溶解残留物并定容至5 mL，0.45 μm有机膜过滤，即为包材提取试验供试品溶液。同法制备空白溶液。

2.3.2 相容性提取试验供试品溶液的制备 模拟并适当加强灭菌工艺条件，考察目标物的浸出情况。取五层共挤输液用袋，剪切成0.5 cm×2 cm条状，按表面积6 cm2· mL-1比例加入醋酸钠林格注射液100 mL；分别取聚丙烯接口、组合盖，剪成小块，按0.2 g·mL-1比例加入醋酸钠林格注射液100 mL，置高压蒸汽灭菌器中，121℃浸提1 h，取出放冷至室温，作为提取试验供试品溶液。固相萃取柱使用前分别用3 mL甲醇和3 mL水依次活化。量取提取试验供试品溶液100 mL，以约1.5 mL·min-1的流速通过固相萃取柱，用6 mL水淋洗，再分别用5 mL甲醇、3 mL二氯甲烷依次洗脱，收集洗脱液，用甲醇稀释至10 mL，0.45 μm有机膜过滤后进样测定。同法配制空白溶液。

2.3.3 相容性迁移试验供试品溶液的制备 固相萃取柱使用前分别用3 mL甲醇和3 mL水依次活化。量取醋酸钠林格注射液100 mL，以约1.5 mL·min-1的流速通过固相萃取柱，用6 mL水淋洗，再分别用5 mL甲醇、3 mL二氯甲烷依次洗脱，收集洗脱液，用甲醇稀释至10 mL，0.45 μm有机膜过滤后进样测定。同法配制空白溶液。

2.4 测定方法

将对照品溶液、供试品溶液与空白溶液分别注入高效液相色谱仪，采用外标法定量。要求抗氧剂对应峰之间的分离度均不小于2.0，空白溶液在抗氧剂的出峰位置不得有干扰。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 取制备好的抗氧剂对照品溶液、空白溶液、供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，抗氧剂1010的保留时间为5.3 min；抗氧剂330的保留时间为6.5 min；抗氧剂1076的保留时间为11.2 min；抗氧剂168的保留时间为12.8 min，各峰分离良好，醋酸钠林格注射液及空白溶液无干扰，典型色谱图见图1。

图1 典型HPLC色谱图Fig 1 Typical HPLC chromatogram

2.5.2 线性关系考察 以二氯甲烷-甲醇（3∶7）溶液稀释抗氧剂对照品，制得含抗氧剂1010质量浓度为0.4596、1.149、2.298、4.596、22.98、45.96、229.8、459.6 μg· mL-1，含抗氧剂330质量浓度为0.4594、1.148、2.297、4.594、22.97、45.94、229.7、459.4 μg· mL-1，含抗氧剂1076质量浓度为1.173、2.346、4.692、23.46、46.92、234.6、469.2 μg· mL-1，含抗氧剂168质量浓度为1.152、2.305、4.610、23.05、46.10、230.5、461.0 μg· mL-1的系列混合对照品溶液，依法测定，以质量浓度为横坐标，响应值为纵坐标，进行线性回归，结果见表1，表明4种抗氧剂在各自质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

表1 线性关系结果 Tab 1 Linearity

2.5.3 精密度试验 取质量浓度均为0.24 μg·mL-1的4种抗氧剂混合对照品溶液，连续进样6次，以峰面积计算RSD值，结果抗氧剂1100、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的峰面积RSD分别为0.32%、0.16%、0.21%、0.25%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 包材提取试验回收率 取五层共挤输液用袋，聚丙烯接口、组合盖，剪成小块混合，精密称定（约2.0 g），按“2.3.1”项下方法制备回收率本底供试品溶液；同法加入低、中、高浓度的抗氧剂对照溶液，制备回收率加标供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表2，表明包材提取试验准确度良好。

2.5.5 相容性提取试验和迁移试验回收率 固相萃取柱使用前分别用3 mL甲醇和3 mL水依次活化。分别取24 μg·mL-1、46 μg·mL-1、240 μg·mL-1的低、中、高质量浓度对照溶液1 mL，加入醋酸钠林格注射液至100 mL，混匀。溶液以约1.5 mL·min-1的流速通过固相萃取柱，用6 mL水淋洗，分别用5 mL甲醇、3 mL二氯甲烷依次洗脱，收集洗脱液，用甲醇稀释至10 mL，0.45 μm有机膜过滤后进样测定，结果见表2，表明提取迁移试验准确度良好。

表2 回收试验考察结果 Tab 2 Recovery

2.5.6 检测限和定量限 取抗氧剂对照品溶液用二氯甲烷-甲醇（3∶7）逐步稀释测定，以各抗氧剂峰信噪比S/N为3的质量浓度作为检测限，以S/N为10的质量浓度作为定量限，结果见表3。

表3 抗氧剂的检测限与定量限 Tab 3 LOD and LOQ of different antioxidants

2.5.7 稳定性试验 将混合对照品溶液分别于0、16、24、48、96 h进样测定，结果抗氧剂1100、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的峰面积RSD值分别为1.4%、1.4%、1.1%、0.90%，表明抗氧剂对照品在二氯甲烷-甲醇（3∶7）溶剂中稳定性良好。

2.6 样品测定

2.6.1 包材提取试验测定结果 取包材样品，照“2.3.1”项下方法进行制备，按外标法计算五层共挤输液用袋、聚丙烯接口、聚丙烯组合盖中各抗氧剂的含量，结果见表4。

表4 包材中抗氧剂含量(%) Tab 4 Content of antioxidants in packaging materials (%)

2.6.2 相容性提取试验测定结果 取醋酸钠林格注射液及包材样品，按“2.3.2”项下方法进行制备，按外标法计算抗氧剂在提取液中的浸出量，提取液中的抗氧剂含量均低于检测限。

2.6.3 相容性迁移试验测定结果 取醋酸钠林格注射液3批样品，照“2.3.3”项下方法进行制备，按外标法计算抗氧剂在注射液中的迁移量，注射液中的抗氧剂含量均低于检测限。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

欧洲药典方法中使用四氢呋喃-乙腈（1∶1）作为溶剂[10]。笔者在试验中发现，抗氧剂168在使用该溶剂配制对照品溶液时不稳定，连续进样6次，峰面积呈连续下降趋势，1.5 h峰面积下降了22%。经过条件优化，最终选择二氯甲烷-甲醇（3∶7）溶液作为溶剂，4种抗氧剂峰形良好，溶液稳定性良好，96 h内峰面积没有明显变化。

3.2 固相萃取小柱的选择

抗氧剂在注射液中的迁移量很小，且不溶于水，本试验采用Cleanert S C18固相萃取柱进行富集。该固相萃取柱为高纯球型硅胶基质的反相C18萃取柱，既通过强疏水作用保留非极性化合物，又避免了普通C18对碱性与极性物质的过度吸附，更适合用于萃取低浓度分析物。

3.3 分析评价阈值（AET）与方法检测限比较

根据《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）》[9]要求，分析测试方法应满足待测物AET的测定要求，选择可达到其能灵敏检出的分析方法。AET计算方法为各抗氧剂最大日暴露量（PDE）与最大剂量的比值，醋酸钠林格注射液的最大日剂量为1000 mL，即AET＝PDE/1000。由文献[21]可知，PDE值有两种计算方法，可采用口服途径PDE数据的10%计算注射途径的PDE值，则抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的PDE值分别为15、5、0.5、5 mg·d-1，其对应的AET值分别为15、5、0.5、5 μg·mL-1；也可按动物NOEL数据计算注射途径的PDE值，抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的PDE值分别为10、200、0.3、2.5 mg·d-1，则其对应的AET值分别为10、200、0.3、2.5 μg·mL-1。本方法抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的提取迁移试验检测限分别为0.011、0.011、0.023、0.046 μg·mL-1，远低于两种方法对应的AET值，灵敏度高，方法可行。

3.4 安全性评估

五层共挤输液袋、聚丙烯接口及聚丙烯组合盖中的抗氧剂单个含量和总含量均小于0.3%，符合欧洲药典[10]和《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）》[9]规定的单个抗氧剂含量不得过0.3%，总量不得过0.3%的限度要求。五层共挤输液袋、聚丙烯接口及聚丙烯组合盖在醋酸钠林格注射液高压121℃浸提1 h的提取试验及迁移试验中检出量均低于检测限，试验结果可为其安全性提供数据参考。