儿童先天性心脏病TBX20 基因突变及功能探讨

金艳梅，刘彩霞，秦珍珍，文云红，李青

先天性心脏病（先心病）是胎儿时期心脏及大血管发育异常所导致的心血管畸形，是最常见的人类出生缺陷和儿童非感染性疾病。临床研究报道先心病的发生率为1%，而遗传学研究发现心脏畸形的发生率为3%～5%，是造成新生儿及婴幼儿死亡的主要原因[1-3]。轻微的先心病部分可以自愈，但复杂、重症先心病经常需要在出生后1 年内甚至几个月、几天内尽早干预，否则可能导致各种并发症，包括脑发育迟缓、肺动脉高压、心律失常、慢性心力衰竭和心原性猝死等[4-6]。虽然随着医疗技术的发展，先心病的诊断、治疗均取得了巨大进步，但病因尚不明确，一些复杂先心病通常需要多次手术甚至心脏移植，给家庭和社会带来巨大的经济负担[7-10]。因此，发现人类先心病可能的易感基因或致病基因，并从分子水平与细胞水平深入研究揭示先心病的发病机制，对下一代的优生优育有着重要意义。

TBX20作为T-box 转录因子家族重要成员之一，表达于心肌发育所需的多种细胞系，包括咽部内胚层、心脏祖细胞、心内膜和心肌细胞，在心血管发生过程中发挥重要作用[8]。本研究通过DNA 测序拟在先心病患儿中寻找、发现新的突变位点，并通过同源建模、双荧光素酶报告基因检测等技术，对新发现的可能存在致病性的突变进行功能分析，探究中国儿童先心病可能的分子发病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集203 例在山西省儿童医院心胸外科接受手术治疗的汉族先心病患儿作为病例组，男性126 例，女性77 例，年龄0～12 岁。全部患儿均通过体格检查、超声心动图和心脏直视或介入手术确诊为先心病，并排除心脏血管之外的其他畸形和遗传代谢性疾病，如马凡综合征、手-心综合征、Noonan 综合征和DiGeorge 综合征等。研究对象的疾病种类见表1。同时收集300 例经超声心动图确认无先心病的健康儿童作为对照组，符合与患儿无血缘关系、性别匹配、无明显遗传和出生缺陷疾病等条件。该研究经山西省儿童医院伦理委员会批准（批件号IRBKY-2019-001）。

表1 病例组203 例先天性心脏病患儿的疾病种类分布

1.2 研究方法

1.2.1DNA 序列分析

两组患儿均采集外周静脉血，采用磁珠法提取白细胞中的基因组DNA，设计合成引物，采用PTC-200 型自动扩增仪（Bio-Rad 公司，美国）对病例组与对照组TBX20基因（GenBank 序列号NM_001077653）的外显子及交界区内含子序列进行PCR 扩增，然后将PCR 扩增产物纯化后经3700 DNA 测序仪（ABI 公司，美国）进行测序分析，利用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）BLAST 程序将测序结果对比分析，检测TBX20基因突变。对检测到突变患儿的家庭成员也进行DNA 序列分析。

1.1.2同源建模

同源建模，又称比较建模，是从已知结构的蛋白质作为模板预测目标蛋白结构的方法。本研究从UniProt 蛋白数据库查询TBX20的氨基酸序列，选取人类TBX3蛋白质结构（PDB 数据库 ID：1H6F）为模板，利用蛋白质结构建模服务器I-TASSER 建立TBX20同源模型，对TBX20野生型及突变后的结构模型进行分析比较。

1.1.3双荧光素酶报告基因检测TBX20基因突变对下游靶基因心钠素（ANF）启动子活性的影响

ANF对房室的形成具有特异性，是心脏发育的重要标志物之一。在心脏发育过程中，T-box 转录因子TBX20需要与同源盒转录因子NKX2.5、锌指转录因子GATA4协同激活下游包括ANF在内的多个目标基因[11-13]。分别检测突变型与野生型TBX20协同转录因子GATA4、NKX2.5对调控ANF启动子活性的影响，以研究基因突变导致蛋白质结构改变后对功能的影响。具体方法如下：（1）将人类野生型TBX20、GATA4、NKX2.5基因全长cDNA 序列分别插入到pcDNA3.1 载体上，构建重组表达载体pcDNA3.1-TBX20、pcDNA3.1-GATA4、pcDNA3.1-NKX2.5。然后通过带有突变位点序列的引物扩增出在本病例组中筛查检测到的突变位点c.187G＞A（A63T）的突变型TBX20基因片段，重组到pcDNA3.1 载体上，获得突变型表达载体pcDNA3.1-TBX20（A63T），对突变体进行转化、鉴定、测序，排除任何其他不必要的序列变异，确保为所需的突变序列。调取ANF基因启动子区域2600 bp 序列构建至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic 上获得ANF-luc 报告载体。（2）将野生型pcDNA3.1-TBX20、突变型pcDNA3.1-TBX20（A63T）及阴性对照pcDNA3.1 分别转染到3 组COS7 细胞（中国科学院干细胞库提供）中。同时每组细胞中均转入ANF-luc 报告质粒、表达海肾荧光素酶的内控报告质粒TK-Rluc 及协同TBX20激活ANF的NKX2.5表达质粒、GATA4表达质粒。48 h 后收集细胞，使用Promega 双荧光素酶报告基因检测系统，E1910 试剂盒检测荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶为报告基因，海肾荧光素酶作为内参基因减少内在变化因素（如培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确性的影响，最后结果以两者的荧光强度比值相对荧光值表示，以提高实验的准确性。相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值，每个样品重复3 次。

1.3 统计学方法

用SPSS 24.0 软件行统计学分析，数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 发现1 个新的TBX20 基因错义突变

病例组与对照组在年龄、性别上差异无统计学意义，病例组先心病患儿的临床特征见表1。通过对203 例无亲缘关系的先心病患儿进行TBX20基因序列分析，在1 例房间隔缺损（ASD）患儿中发现了一个新的错义突变c.187G＞A（A63T），位于TBX20基因第2个外显子，DNA 序列中第187 位鸟嘌呤突变为腺嘌呤，导致氨基酸序列中第63 位丙氨酸变为苏氨酸，而在对照组中未发现该变异（图1A）。在NCBI 数据库对这个突变位点进行查找发现TBX20的第63 位氨基酸（丙氨酸）在不同物种中高度保守（图1B）。我们对检测到错义突变患儿的父母、同胞妹妹的血样也予以收集并提取DNA 进行了突变检测。其母亲和同胞妹妹也携带同样的突变。她们主诉没有明确的先心病病史，但未曾做过超声心动图检查。当追踪超声心动图检查之后发现，患儿母亲有一直径7.0 mm 的ASD，其同胞妹妹有直径4.5 mm 的卵圆孔未闭和1.9 mm 的动脉导管未闭。该家庭中检测到突变A63T 的3 人均患有ASD 或者卵圆孔未闭，提示该新发现的错义突变A63T 很可能与先心病相关。新发现的TBX20基因突变位点A63T 已提交到GenBank 数据库中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）并获得序列号：EU636777。

图1 TBX20 基因测序结果及氨基酸序列比对分析

2.2 同源建模显示TBX20-A63T 导致TBX20 蛋白构象发生改变

针对上述家系中发现的TBX20错义突变A63T，运用I-TASSER 同源建模服务器，以TBX3为模板对野生型及突变型TBX20建模，对两种蛋白质的结构进行预测分析显示TBX20-A63T 导致TBX20蛋白构象发生改变。如图2 所示，野生型TBX20第63位的丙氨酸Ala63 与第65 位的甘氨酸Gly65、第68位的甘氨酸Gly68 相邻并形成氢键，丙氨酸突变成苏氨酸之后，苏氨酸Thr63 与周围残基之间的关系发生改变，第63 位的苏氨酸Thr63 与第65 位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 间的氢键断裂，与第62 位的天冬氨酸Asp62、第64 位的组氨酸His64形成了新的氢键，导致蛋白质构象发生变化。

图2 同源建模显示的TBX20 蛋白质构象

2.3 TBX20-A63T 对下游靶基因ANF 的激活作用增强

体外细胞实验双荧光素酶报告基因活性检测结果见表2，阴性对照、野生型、突变型中相对荧光值分别2.00±0.07、5.22±0.35 和6.37±0.50，三者比较差异有统计学意义（F=121.40，P＜0.0001）。野生型、突变型的相对荧光值均高于阴性对照，差异具有统计学意义（P均＜0.0001）。突变型的相对荧光值高于野生型，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 双荧光素酶系统检测A63T 对ANF 活性的影响

3 讨论

先心病是最常见的人类出生缺陷和儿童非感染性疾病，是导致1 岁以下婴儿死亡的主要原因之一[2-3]。先心病的发生与环境、遗传等多因素相关，越来越多的研究认为遗传因素在先心病的发生中发挥着重要作用，但具体机制尚不明确[14-16]。

T-box 转录因子家族成员在胚胎发育过程中各自发挥不同的作用，TBX20是T-box 基因家族的重要成员之一，属于TBX1亚家族，对心脏形态结构的形成和成熟心功能的维持具有重要作用[17]。TBX20位于第7 号染色体（7p14.2），有8 个外显子，其289～888 核苷酸及相应氨基酸编码T-box DNA 结合结构域，通过此功能结构域与特异DNA 序列结合，从而调控转录[17-18]。TBX20作为家族重要成员表达于心肌发育所需的多种细胞系[8]。斑马鱼TBX20基因突变可引起心脏祖细胞数量大大减少，形成一个小的、狭长的无功能心脏。而TBX20过表达会导致心脏增大，心肌细胞明显增多[3]。

此前有研究发现人类TBX20基因突变与多种先心病的发生相关，包括ASD、右心室双出口、法洛四联症和室间隔缺损等[19-23]。Huang 等[24]在一个有先心病家族史患者的TBX20基因中发现一个新的突变K274X，它在编码T-box DNA 结合结构域的一个外显子中引入了一个终止密码子，这将产生一种新蛋白，该蛋白在T-box DNA 结合结构域中被截断，缺乏C 端存在的转录激活和转录抑制域。在COS7 细胞中的功能分析研究证明，该突变型TBX20蛋白与野生型蛋白相比对ANF的转录激活作用显著下降，甚至无转录激活活性。Posch 等[19]研究了170 例互不相关的ASD 患者TBX20的全部编码序列，在1 例有家族史的患者中发现了一个新的I121M 突变，在COS7细胞中进行研究显示，在锌指转录因子GATA4和同源盒转录因子NKX2.5共存的情况下，该I121M 突变导致TBX20对ANF的转录激活作用显著提高。这些发现提示TBX20基因突变可能是先心病的发病原因。

本研究通过对203 例先心病患儿进行TBX20基因序列研究，在1 例ASD 患儿中发现了一个新的错义突变c.187G＞A（A63T），该突变导致TBX20上第63 位的非极性、疏水性丙氨酸变为极性、亲水性的苏氨酸。在NCBI 数据库对这个突变位点进行查找显示TBX20的第63 位氨基酸（丙氨酸）在不同物种中高度保守。保守性是指某一序列在进化演变过程中在不同的物种中一直保留，这种序列一般都发挥着很重要的功能，往往有其不可代替性。我们对该患儿的父母、同胞妹妹进行检测发现其母亲和同胞妹妹也携带同样的突变，而且其母亲患有ASD，其同胞妹妹患有卵圆孔未闭和动脉导管未闭。这一家系中3 位成员携带同样突变A63T 又同时有ASD 或卵圆孔未闭的临床表型特征，提示该错义突变A63T很可能与ASD 的发生相关。

基因错义突变会导致氨基酸和蛋白质发生变化，我们进而通过蛋白质结构同源建模对突变A63T进一步行空间结构预测及分析研究。以TBX3为模板对TBX20野生型及TBX20-A63T突变体进行建模，发现野生型TBX20第63 位的丙氨酸Ala63 与第65位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 相邻并形成氢键，丙氨酸突变成苏氨酸之后，导致苏氨酸与周围残基之间的关系发生变化，第63 位苏氨酸Thr63 与第65 位的甘氨酸Gly65、第68 位的甘氨酸Gly68 间的氢键断裂，与第62 位的天冬氨酸Asp62、第64 位的组氨酸His64 形成了新的氢键，导致蛋白质构象发生变化。各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象与特定的生物学功能相对应，结构与功能是高度统一的。该突变影响了TBX20蛋白质的空间构象，很可能会影响其生物学功能，导致先心病的发生。

在此基础上，我们通过体外细胞实验进一步对突变A63T 进行功能研究。在心脏发育过程中，TBX20与NKX2.5、GATA4等转录因子协同激活下游的多个目标基因，包括CX40、CX45、ANF[11-13]。ANF是心脏发育过程中一种极其敏感的重要标志物，对房室的形成具有特异性[13]。TBX20识别并结合ANF启动子中的T-half 位点（与5-AGGTGTGA-3一致的DNA 序列），TBX20基因突变可能通过改变下游靶基因ANF启动子活性参与先心病的发病机制[13，25-27]。我们在COS7 细胞中分别转染等量的突变型TBX20-A63T 表达质粒、野生型TBX20表达质粒以及协同作用基因GATA4、NKX2.5，然后用双荧光素酶报告基因系统检测ANF启动子的活性。通过检测TBX20、GATA4、NKX2.5协同调控过程中TBX20野生型与突变型对ANF启动子活性的影响来研究TBX20-A63T 的功能。研究发现突变型对ANF启动子的激活作用较野生型更强，差异具有统计学意义（P＜0.01）。因此认为突变A63T 有可能通过上调ANF的活性而参与先心病的发生。

综上所述，本研究在1 例汉族先心病患儿中发现了一个新的TBX20基因错义突变A63T，并在两位同样患有先心病的家庭成员中得到验证，进而对该突变进行了蛋白结构同源建模分析及体外细胞功能研究。研究结果表明该突变导致蛋白质空间构象发生改变，可能通过上调下游靶基因ANF启动子的活性而参与先心病的发病机制，拓宽了ASD 的基因突变谱，为先心病的发生机制提供了一点新思路，本课题组也将会在下一步的动物模型中对其功能进一步深入验证和探讨。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突