基于生物信息学方法分析胰腺癌免疫浸润及其临床意义

张铁英,王秋莹,方 堃，黄 颜

胰腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，5年生存率不足10%，目前主要以手术、放疗、化疗为主，但效果并不理想[1]。胰腺癌特殊的肿瘤微环境可通过多种方式促进肿瘤转移，而肿瘤浸润免疫细胞(TIIC)与肿瘤的进展及预后密切相关[2]。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和Treg细胞已被证明与胰腺癌的预后、肿瘤的生长、侵袭和临床表型密切相关[3-4]，在肿瘤免疫中许多细胞发挥着相反的作用，如Th1和Th2、Treg与细胞毒性T细胞、M1及M2巨噬细胞等。肿瘤组织中免疫细胞亚群的比例决定了肿瘤中的免疫反应及肿瘤的增殖和侵袭[5]，过去对免疫细胞的研究主要采用流式细胞仪和免疫组化法，但尝试一次区分20多种免疫细胞亚型的工作量可能非常巨大[6]。单细胞类型分析方法(CIBERSORT)算法对于大样本免疫细胞的鉴定具有较高的准确率和独特优势[7-9]，我们使用CIBERSORT算法计算包括淋巴细胞、巨噬细胞等22种免疫细胞，以说明免疫细胞比例，帮助了解不同样本中每个免疫细胞亚型的作用，为开展胰腺癌免疫治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料：PAAD 队列的 RNA-seq 数据(FPKM 值)从 Gene Expression Omnibus (GEO) 网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 下载，包括 3 个文件 (GSE16515_series_matrix.txt.gz，GSE46234_series_matrix.txt.gz 和 GSE16515_series_matrix.txt)。收集上述3个文件中匹配的肿瘤和正常组织的基因表达矩阵，从TCGA数据库中检索胰腺癌的临床相关信息，主要包括肿瘤患者的生存情况，具体收集182例患者的转录组表达信息、存活时间和肿瘤病理阶段，然后使用Perl软件(mRNA_merge.pl) 合并数据，使用limma-Voom标准化方法(观察水平的方差建模)对RNA-seq进行标准化。

1.2 CIBERSOFT 标准化数据处理：TIIC的定量分析使用CIBERSOFT算法进行。CIBERSOFT方法是一种反卷积算法，利用特定标记基因的特征对每个免疫细胞亚型进行评分，并根据评分计算免疫细胞亚型的比例[10]。为了提高结果的可靠性，CIBERSOFT算法使用蒙特卡罗采样来获得每个样本的反卷积P值，删除P>0.05 的数据后，将标准化的遗传数据上传到CIBERSOFT网站(https://cibersort.stanford.edu/index.php)，该网站运行100个对齐的默认签名矩阵。

1.3 22种免疫细胞：包括适应性免疫细胞，记忆性B细胞、幼稚B细胞、活化的CD4+T记忆性细胞、未活化的CD4+T记忆性细胞、幼稚CD4+T 细胞、CD8+T细胞、滤泡辅助性T细胞、γδT细胞和调节性T细胞；先天性免疫细胞：活化的树突状细胞、未活化的树突状细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞(M0-M2)、活化的肥大细胞、未活化的肥大细胞、单核细胞、活化的NK细胞、未活化的NK细胞、中性粒细胞和浆细胞。

1.4 统计学方法：通过CIBERSORT 采集P<0.05的样本进行后续分析，利用R软件通过Pearson相关系数建立22种不同免疫细胞亚型之间的相关性。Wilcox检验用于检验2组之间的统计数据，Kruskal-Wallis检验用于比较2组或更多组之间的差异[11]。为了显示不同免疫细胞亚型与肿瘤之间的相关性，使用了R包“pheatmap”生成热图。Kaplan-Meier分析用于确定免疫细胞类型与生存时间之间的相关性，并使用R软件分析生存曲线。所有分析均由R软件4.0.2版本执行，并且执行的所有统计测试都为双向。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌中免疫细胞比例及细胞间的相关性：通过对正常组织和肿瘤组织的数据处理，获得了PAAD中22个免疫细胞亚群的概况，用CIBERSORT 算法计算出2组样本之间的显著差异性。与正常组织相比，肿瘤组织中记忆B细胞的比例降低，而M0巨噬细胞增多(图1，封二)。PAAD中的免疫细胞显示出明显的相关性，其中，M2巨噬细胞与Tfh呈明显的正相关性(Pearson相关系数=0.52)，其次是幼稚CD4+T细胞。CD4+T 细胞与幼稚 B 细胞呈正相关(Pearson 相关系数=0.51)，而 M2 巨噬细胞和浆细胞呈明显的负相关性(Pearson 相关系数=0.64)，其次是 Tfh 和浆细胞。M0巨噬细胞和肥大细胞均呈负相关(Pearson相关系数=0.48)。PAAD中免疫细胞的比例与正常组织间差异有统计学意义，免疫细胞之间的相互作用可能参与了肿瘤调控。

2.2 TIIC亚型的临床意义：利用TCGA数据库中收集肿瘤患者的临床生存时间和肿瘤分期，并通过CIBERSORT从TCGA原始数据中过滤掉的数据。其余128例患者采用SPSS25.0软件进行分析，比较特定TIIC和PAAD患者的总生存时间。Kaplan-Meier 生存曲线表明，静息肥大细胞与总体生存率率呈负相关性 (P<0.05),见图2(封二)。此外，通过TCGA数据库中的病理分级数据分析,结果显示滤泡辅助性 T 细胞 (Fht) 与病理分级呈正相关性(P<0.05),见图3(封二)。

3 讨论

免疫系统是身体防御的门户，也是对抗肿瘤、炎症和其他疾病的重要武器，在这种防御中免疫细胞是必不可少的。大量研究表明，肿瘤组织中的免疫细胞在肿瘤的影响下具有免疫抑制作用，微环境通常会促进肿瘤的发展，原因尚不清楚。因此，研究肿瘤免疫浸润对于了解肿瘤微环境和肿瘤免疫机制非常重要。本研究利用生物信息技术系统分析肿瘤中的22种免疫细胞，以了解免疫细胞与肿瘤的相关性以及免疫细胞之间的关系，更深入地了解免疫细胞在肿瘤组织中的作用。

3.1 胰腺癌与正常组织中免疫浸润的关系：根据PAAD中TIIC的比例可以看出，浆细胞、M2巨噬细胞和M0巨噬细胞占肿瘤细胞的比例最大,从整体数据来看，浆细胞是正常组织和肿瘤组织中最主要的免疫细胞，但与正常组织相比，浆细胞在肿瘤组织中的比例仍然较低。相关研究表明，浆细胞在肿瘤免疫中发挥着积极作用，肿瘤组织通常通过抑制浆细胞来减少肿瘤特异性抗体的产生，抗体与肿瘤细胞结合后会抑制靶蛋白和补体的活化，从而创造有利于肿瘤生长的环境[12]。此外，有研究表明，浆细胞在体外以抗原特异性和Fas配体依赖的方式直接杀伤肿瘤细胞[13],由于浆细胞是肿瘤免疫过程的重要组成部分，而作为免疫功能储备的记忆B细胞不能忽略。在所有免疫细胞中，与正常组织相比，肿瘤组织中记忆B细胞的比例下降最为显著。先前的研究证实，黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌患者的记忆B细胞也显著减少，记忆B细胞在肿瘤记忆免疫反应发挥着重要作用，可能是肿瘤对其免疫环境的抑制性调节，促进肿瘤免疫逃逸[14-15],肿瘤通过释放多种细胞因子诱导外周单核细胞进入肿瘤组织，成为肿瘤相关巨噬细胞。按照传统的分类，巨噬细胞可分为经典的M1型或活化的M2型和未分化的M0型。巨噬细胞的极化与肿瘤的发生密不可分,不同的表型对肿瘤的影响几乎完全相反，一般来说M1型巨噬细胞抑制肿瘤的生长和侵袭，而M2型巨噬细胞对肿瘤的作用却相反。在PAAD样本中，M0型巨噬细胞在22个免疫细胞中呈现出最明显的下降趋势。有研究证实膀胱癌患者肿瘤组织中M0巨噬细胞的含量降低[16]，肿瘤组织中M0巨噬细胞的减少可能会受到肿瘤细胞的影响，极化为M1或M2巨噬细胞，从而参与肿瘤调控。免疫机制不是由单个免疫细胞所实现，免疫细胞之间的激活或抑制对肿瘤的发展至关重要。数据显示，PAAD组织中的Fht和M2巨噬细胞正相关性最强，均可促进肿瘤细胞生长。研究表明，Fht可通过抑制胃癌IL-10+B细胞而增加肿瘤发生的风险[17]，在血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和滤泡性T细胞淋巴瘤等恶性肿瘤中，Fht 细胞可能通过调节 CD40L、IL-4和IL-21的产生来促进肿瘤细胞的存活和增殖[18]。M2型巨噬细胞可促进PAAD患者肿瘤的生长和侵袭，而M2型巨噬细胞表达的增加往往意味着患者的预后较差[19-20]。M2型巨噬细胞与浆细胞呈强负相关，浆细胞在肿瘤组织中一般具有抗肿瘤特性，这与M2型巨噬细胞完全相反。

3.2 胰腺癌免疫浸润与预后的关系：分析免疫细胞与生存时间的关系，高肥大细胞组患者的生存时间低于低肥大细胞组，差异有统计学意义(P<0.05)。研究表明，肥大细胞分泌的蛋白酶、类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可直接或间接诱导肿瘤血管生成，是诱导肿瘤血管生成的关键因素，影响肿瘤的生长和进展[21]，肥大细胞与肺癌预后不良有关[21]。研究表明，淋巴浸润、神经周围浸润和雌激素受体阳性与肿瘤内肥大细胞浓度呈正相关性，与存活时间呈负相关性[22]。

3.3 胰腺癌免疫浸润与临床病理的关系:肿瘤的病理分期往往是决定手术方式的最重要因素之一，特别是对于预后较差的导管腺癌和腺泡细胞癌。本研究中Fht与病理分级呈正相关性，说明Fht比例越高，病理分级越高，肿瘤分化程度越低，恶性程度越高，较高比例的Fht与较高的肿瘤分级相关[6]。

本研究结果是基于临床样本的统计算法分析，虽然之前的研究报道验证了算法的准确性，但仍需要后续的实验验证。另外，样品是在 GEO 收集的，为了扩大样本总数，引入了较小的数据集，这可能对结果产生了一定影响。