LncRNA-NEAT1在子宫内膜癌中的临床病理意义及其在预后评估中的价值

罗艳露,范江涛,杨家湟

核富含丰富的转录本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是LncRNA的一种，在病毒感染及肿瘤等疾病的发生中发挥重要作用[1]。目前已有研究报道了NEAT1在多种实体瘤中表达异常，例如肺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌等，其高水平表达与肿瘤的不良结局相关[2]。表明了NEAT1具有致癌特征，此外，NEAT1可用作癌症诊断和预后预测的生物标志物，在作为治疗肿瘤的新靶点上蕴含巨大的潜力。

近年来关于NEAT1在子宫内膜癌(endometnal cancer,EC)的基因分析研究表明，在EC组织及细胞系中NEAT1的表达显著上调，抑制NEAT1的表达可以减少侵袭性EC细胞的增殖、侵袭，提示了NEAT1可以促进EC的发生发展[3-7]。但关于NEAT1与EC临床病理参数的关系尚不清楚，及其对EC生存预后的影响研究较少。为进一步探索NEAT1对EC的临床病理意义及生存价值，本研究检测了EC患者的EC灶组织及相对应的癌旁正常内膜组织中NEAT1的表达情况，探索NEAT1表达水平与EC不同临床病理参数的相关性及其生存预后的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本的收集

本研究选取了36例EC患者在手术中切除的癌灶组织及相对应的癌旁正常内膜组织。癌旁组织为离癌灶组织≥2 cm的正常内膜组织。离体组织放入液氮或-80℃冰箱保存。样本来自2016年7月至2017年2月在广西医科大学第一附属医院住院的符合条件的EC患者。所有病历均由病理科确诊为EC。纳入标准：确诊原发EC，初始治疗为接受子宫及双附件切除+盆腔淋巴结切除术±腹主动脉旁淋巴结切除术的患者(当术中探查发现可疑腹主动脉旁淋巴结转移或者具有高危因素者行腹主动脉旁淋巴结切除术或者活检术)。排除标准：手术前接受过激素治疗、化疗或者放疗的患者，合并其它恶性肿瘤。本研究提前获得了患者及家属的同意并签署相关知情同意书，并获得医院伦理委员会的批准。所有样本均具备完整的临床病理资料。

1.2 通过RT-qPCR计算NEAT1的相对表达量

EC组织和癌旁正常组织样本的总RNA提取是利用经典的Trizol试剂法，提取到的总RNA通过紫外分光光度计测量，浓度范围为：425～4 110 ng/uL，纯度(A260/A280)为1.85～2.05。

按照逆转录试剂说明书规范进行实验操作，取1μg总RNA放入反应体系中，在PCR仪(Gene Amp)进行逆转录反应，得到cDNA。反应条件：37℃，15 min；85℃，5 s。

本次RT-qPCR选用GAPDH作为内参基因，它的上游引物为：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物为：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。目的基因NEAT1的上游引物：TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG。下游引物为：TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC，RT-PCR反应体系为20 μL,其中cDNA 2 μL。反应仪器：7500荧光定量PCR仪。反应条件：95℃，30 s；95℃,5 s；60℃ 34 s；95℃ 15 s； 60℃，1 min，95℃，15 s。共40个循环。在本次实验中计算NEAT1的基因表达量的公式为2-△CT，△CT=CT癌灶/正常-CTGAPDH。

1.3 临床病理病历收集

通过广西医科大学第一附属医院病历记录获得，收集包括年龄、临床-病理分期、淋巴结转移情况、脉管侵犯、腹水检测、深肌层侵犯、肿瘤大小、组织分化、分子分型等相关资料。通过电话随访及就诊追踪，获得36例患者截至2020年11月的生存预后情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NEAT1在子宫内膜癌中的表达情况

通过公式2-△CT计算每个样本表达量，得到了36例患者的EC灶组织NEAT1的表达量均高于其相对应的癌旁正常内膜组织，癌灶组NEAT1表达量：1.431±0.724，正常组为：0.274±0.071。NEAT1在EC组织中的表达明显高于正常内膜组织(t=9.538,P<0.001)。

2.2 NEAT1在子宫内膜癌中的临床病理意义

根据临床、病理病历的记录，将36例患者以年龄、分期、淋巴结转移、脉管侵犯、深肌层浸润、腹水癌细胞检测结果、肿瘤组织分化、肿瘤大小、分子分型等常见的临床病理因素作为依据进行分组，结果显示，NEAT1的表达在分期、淋巴结转移、深肌层浸润、腹水癌细胞检测结果、肿瘤组织分化、肿瘤大小、分子分型之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而在年龄、脉管侵犯之间比较，差异无统计学意义(P>0.05),详见下页表1。

表1 NEAT1在各个临床病理因素中表达情况的比较

2.3 NEAT1表达水平与子宫内膜癌各临床病理因素及生存预后的关系

以36例患者癌灶组织NEAT1表达量的中位数水平为阈值，将36例患者分为高、低表达两组，每组各18例。四格表χ2检验比较两组患者年龄、分期、淋巴结转移、脉管侵犯、深肌层浸润、腹水癌细胞检测结果、肿瘤组织分化、肿瘤大小、分子分型等一般资料比较，结果显示差异均无统计学意义(P>0.05)，详见下页表2。

表2 NEAT1高、低表达两组临床病理因素比较 [例(%)]

2.3.1 NEAT1高、低表达两组生存预后情况的比较 Kaplan-Meier法计算高表达组3年的中位生存时间为(36.289±4.356)月,3年生存率为53%，而低表达组的3年的中位生存时间为(48.144±2.478)月,3年生存率为77%，Log-rank检验比较两组生存曲线差异有统计学意义(Log-rankχ2=4.809,P=0.028)，详见下页图1(A)。表明了NEAT1的高表达降低了患者的生存率。另外，本研究还发现高表达组3年无瘤生存率为42%，中位无瘤生存时间为(36.196±4.264)月，而低表达组3年无瘤生存率为72%，中位无瘤生存时间为(50.078±2.092)月，两组生存曲线比较差异有统计学意义(Log-rankχ2=7.848,P=0.005)，详见下页图1(B)，表明NEAT1可以影响EC患者的复发。

图1 (A)高低表达两组总生存曲线比较

图1(B) 高低表达两组无瘤生存曲线比较

2.3.2 影响患者总生存和无瘤生存的单因素及多因素Cox回归分析 单因素Cox回归分析结果显示，NEAT1表达高低、临床分期、淋巴结转移、脉管侵犯和组织分化高低程度与患者的总生存期有关(P<0.05)；NEAT1表达高低、临床分期及淋巴结转移与患者的无瘤生存率有关(P<0.05)。多因素Cox回归分析，NEAT1高表达(HR=0.101，95%CI:0.01-0.981，P=0.048)是影响总生存的独立危险因素，也是影响患者无瘤生存的独立危险因素(HR=0.081， 95%CI:0.01-0.66，P=0.019)，详见表3。

表3 影响患者总生存及无瘤生存的单因素和多因素Cox回归分析结果

3 讨论

越来越多的研究证明，LncRNA是癌症潜在的生物学标志物，它们与许多基因相互作用，而这些基因调节的细胞表型与肿瘤进展相关，包括细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡对抗。NEAT1作为最常见的LncRNA之一，在各种实体癌症中表达上调，癌症组织样本中NEAT1的表达水平与癌症进展、肿瘤转移、临床结局有关[8]。Zhang M等[9]证实了NEAT1在直肠癌患者的癌组织中表达显著上调，改变直肠癌细胞中NEAT1的表达可以导致体内及体外癌细胞的增殖、迁移及侵袭的显著改变，此外，他们还探索了NEAT1的表达在直肠癌中的临床病理意义，提出了NEAT1与直肠癌的不良预后相关。Wen S等[10]发现了NEAT1-1 m6A能够促进有骨转移的前列腺癌PDXs中新复合物CYCL INL1/CDK19的致癌功能，表明了NEAT1-1m6A在调节前列腺癌进展中具有重要作用，可能是癌症治疗和诊断的新靶点。Ma F等[11]研究表明NEAT1通过促进肺癌细胞的生长来提高肺癌细胞的生存能力和迁移能力，另一方面，他们还发现NEAT1在肺癌组织及肺癌细胞系中过表达，这种异常表达与肿瘤分期、淋巴结转移密切相关，为肺癌的发病机制提供新思路。Ding N等[12]发现NEAT1在卵巢癌细胞株中显著上调，并能通过miR-34a-5p/BCL2调节卵巢癌细胞的增殖和凋亡，提示NEAT1可以调控卵巢癌的进展，为卵巢癌患者提供一种潜在的治疗途径。关于NEAT1与EC，目前学者们一致认为NEAT1在EC组织或细胞系中表达上调，且NEAT1可以促进EC的进展。本研究在相关研究的基础之上，进一步探索NEAT1在EC中的临床病理意义，评估其作为EC患者生存预后生物学标志物的潜力，旨在为EC临床诊治提供新策略。

NEAT1的差异性表达在EC的发生及进展过程中扮演重要角色。Dong P等[13]发现NEAT1在EC细胞系中呈高表达，在体内和体外的研究中利用ShRNA抑制NEAT1的表达可以减少侵袭性EC细胞的增殖、侵袭及异种移植肿瘤生长，进一步探索其作用机制发现NEAT1是作为肿瘤抑制因子miR-361致癌体，直接靶向癌基因STAT3来调控肿瘤细胞表型，指出NEAT1是积极推动EC进程的重要因子。另外，关于NEAT1在人体EC组织及正常内膜组织中的差异性表达曾被报道过4次，这些研究均证实了EC组织中的NEAT1的表达高于正常内膜组织，还在细胞水平上证实了NEAT1通过靶向包括miR-144-3p、miR-146b-5p、miR-202-3p等小核酸分子来实现对EC细胞侵袭、生长等细胞行为的调控[14]。与这些研究一致，我们的研究结果表明NEAT1表达水平与EC进展之间存在正相关，EC组织中NEAT1表达可能是EC的诊断及预后生物标志物。下一步计划进行体外和体内研究，以鉴定NEAT1在EC细胞恶性表型中的作用和机制。

关于NEAT1在EC中的临床病理意义，Li Z等[4]研究表明NEAT1的表达与FIGO分期、淋巴结转移正相关，而与患者年龄、深肌层侵犯、组织分级及更年期状态无明显关联。本研究在此基础之上进行更进一步、更全面的探索，结果揭示了NEAT1与EC患者临床分期、淋巴结转移、深肌层浸润、腹水癌细胞阳性、组织分化及肿瘤大小之间明显相关。因此，我们认为在临床检测NEAT1的表达对预测EC转移和恶化可能是有价值的，当然这还需要进一步的体内外实验验证。此外，本研究探索NEAT1对EC生存预后的影响，结果发现NEAT1高表达会缩短EC患者的生存时间及增加患者复发的风险，据此，我们可以大胆提出NEAT1作为EC新的潜在诊断和治疗靶点的假设。尽管样本数量很少，但由于采用了严格的纳入和排除标准，并严格选择匹配的临床病理因素以降低有争议结果的可能性，因此我们认为样本是具有合理性和代表性的。

综上所述，我们认为NEAT1可能促进EC进展及转移，影响EC的生存预后，可以作为监测EC进展及预后的生物学标志物，具备作为治疗EC新靶点的潜力。然而，未来仍需要更多、更深入的研究来证实NEAT1的临床应用价值。