条芩与枯芩的指纹图谱建立、抗炎活性及谱效关系研究

贾传青 郭兰萍 王晓 于宗渊 陈龙 董红敬

关键词黄芩;条芩提取物;枯芩提取物;指纹图谱;抗炎活性;谱效关系

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，为临床常用中药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效[1]。黄芩生长至3年以上者，其根部上段（老根）木心出现中空、腐朽，但下段仍致密、坚实。由其坚实的下段根部所制饮片为条芩，由其中空、腐朽的上段根部所制饮片为枯芩。《本草经集注》记载：“圆者名条芩为胜，破者名宿芩，其腹中皆烂，故名腐肠，惟取深色坚实者为好”[2];《药品化义》曰：“一品宜分两用，盖枯芩体轻主浮，专泻肺胃上焦之火，而条芩体重主降，专泻大小肠下焦之火”[3];《本草易读》记载：“中枯而飘者名枯芩，泻肺利气，止嗽化痰，除风热，清肌表宜之。细实而坚者名条芩，泻大肠火，除湿止痢，养阴退阳”[4]。由此可见，条芩与枯芩的划分是历代中医药学家的实践总结。然而，目前临床处方均为“黄芩”，并未对条芩和枯芩进行区分，这可能会影响黄芩临床应用的精准化。

现代研究表明，黄芩含有黄酮、挥发油、多糖等活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性，其抗炎活性尤为突出[5-8]。炎症是导致多种疾病的关键因素，包括心脑血管疾病、肺疾病等[9]。因此，从成分及抗炎活性角度探讨条芩与枯芩的区别，对两者的临床精准应用具有重要的意义。中药指纹图谱是中药谱效关系研究的基础，其能够整体、系统地表征中药主要化学成分的相似性;化学模式识别可体现样品间的差异，从而全面、准确地反映样品的内在质量[10-11]。基于此，本研究拟采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立条芩和枯芩的指纹图谱，并进行化学模式识别分析;同时拟采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW264.7 细胞建立炎症模型，探讨条芩、枯芩抗炎活性的差异，并通过灰色关联分析法初步研究其谱效关系，旨在为条芩与枯芩的抗炎活性物质基础研究及临床应用提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有ACCHROM-S6000 型HPLC仪[华谱科仪（北京）科技有限公司]，Eclipse Ts2 型倒置显微镜（日本Nikon 公司），Spark 型多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司），BXM-50VE型立式壓力蒸汽灭菌器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司），Scientz-10N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司），DZKW-C型单列双孔电热恒温水浴锅（上海树立仪器仪表有限公司），TGL-16A型医用离心机（湖南平凡科技有限公司），LAB DANCER S25 型微型涡旋振荡器（德国IKA 公司），HFsafe-1200LC型生物安全柜、HF90 型CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

DMEM 高糖培养基（批号GP21080140836）购自武汉赛维尔生物科技有限公司;胎牛血清（fetal bovineserum，FBS，批号1928703）购自以色列Biological Industries公司;LPS（批号059M4173V）购自美国Sigma公司;二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号1209M036）、MTT（批号823L051）均购自北京索莱宝科技有限公司;一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒（ 批号032519190612）购自上海碧云天生物技术有限公司;小鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号分别为279559-002、267273-007）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司;乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。

5 批条芩和5 批枯芩药材分别购自各地药材市场、药房或自采，经山东中医药大学药学院李佳教授鉴定为唇形科黄芩属植物黄芩S. baicalensis Georgi 的干燥根。购买或采收后，各药材样品按2020 年版《中国药典》（一部）“黄芩”项下“黄芩片”的制备工艺制成相应饮片[1]，备用。5批条芩和5 批枯芩药材样品的来源信息见表1。

1.3 细胞

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 细胞株购自中国医学科学院基础研究所。

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 供试品溶液的制备称取各饮片粉末约0.5 g，加入10 倍量的70%乙醇，称定质量，加热回流提取2 h，放冷，再次称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，经0.45μm微孔滤膜，滤过，即得。

2.1.2 色谱条件以Symmetry® C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～15 min，10%A→20%A;15～36min，20%A→25%A;36～50 min，25%A→38%A;50～55 min，38%A→45%A;55～65 min，45%A→65%A;65～75 min，65%A→80%A;75～80 min，80%A;80～86 min，80%A→10%A;86～91 min，10%A）;流速为1.0 mL/min;检测波长为280 nm;柱温为25 ℃;进样量为5 μL。

2.1.3 精密度试验取“2.1.1”项下供试品溶液（编号K1），按“2.1.2”项下色谱条件连续进样测定6 次，以峰5为参照峰（由于峰5 的保留时间适中、分离度良好、峰面积相对较大，故以其为参照峰），计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.14%～0.58%（n=6），相对峰面积的RSD为0.46%～3.21%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.4 稳定性试验取“2.1.1”项下供试品溶液（编号K1），分别于室温下放置0、3、6、9、15、24 h 时按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，以峰5 为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.17%～1.14%（n=6），相对峰面积的RSD为1.23%～4.66%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h 内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验精密称取饮片样品（编号K1）粉末，共6 份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，以峰5 为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.14%～0.64%（n=6），相对峰面积的RSD为0.67%～3.76%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.6 指纹图谱的建立分别取5 批条芩、5 批枯芩饮片样品粉末，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》，以色谱峰分离度好、信号强度相对较高的K1 样品为参照，经多点校正后，采用中位数法生成条芩和枯芩的HPLC叠加指纹图谱及对照指纹图谱（R）。结果显示，5批条芩和5批枯芩饮片共有15个共有峰，详见图1。

2.1.7 相似度评价以对照指纹图谱（R）为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》对5 批条芩和5 批枯芩的指纹图谱进行相似度评价。结果显示，5 批条芩和5 批枯芩指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.990，表明指纹图谱暂无法区分条芩与枯芩。结果见表2。

2.2 主成分分析

以15 个共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA 14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。结果显示，所建PCA模型的解释能力参数（R2X）为0.962，预测能力参数（Q2）为0.613，均大于0.5，表明该模型拟合良好[12]。条芩与枯芩分别位于PCA得分图（图2）的两侧，其中条芩的聚集程度较高，枯芩则较分散，提示该法可区分条芩与枯芩。载荷图中，变量离原点越远，表示其对主成分的影响权重越大[13]。由共有峰的PCA 载荷图（图3）可知，主成分1 的主要信息来自于峰1、3～4、6、10～15，主成分2 的主要信息来自于峰2、5、7～9，其中对主成分1 影响权重较大的变量为峰12、14、15，对主成分2影响权重较大的变量为峰2、7。

2.3 正交偏最小二乘法-判别分析

以15 个共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partialleast-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）是评价变量对分类贡献的常用指标，VIP 值>1 表示该变量对分类的贡献率较大，为组间特征性成分[14]。本研究以VIP 值>1 为标准筛选影响条芩和枯芩质量的差异标志物。结果显示，共有8 个峰的VIP值>1，依次为峰14、12、15、6、10、13、11、4，表明这8 個峰对应的成分可能是影响条芩和枯芩质量的差异标志物。结果见图4。

2.4 抗炎活性的测定

2.4.1 提取物和样品母液的制备取条芩、枯芩饮片各约30 g，加入10 倍量的70%乙醇，加热回流提取2 h，滤过，取滤液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，制得各饮片样品的提取物冻干粉（得率为47%～52%）。称取各冻干粉10 mg，加DMSO 溶解，制成质量浓度均为200mg/mL（以提取物质量计）的样品母液，备用。

2.4.2 细胞毒性评价采用MTT法进行检测。取对数生长期的RAW264.7 细胞，按1.0×106个/mL 接种于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h（培养条件下同）后，弃去上清液。将细胞分为空白对照组和给药组，每组设置6 个复孔。空白对照组加入含5%FBS 的DMEM高糖培养基，给药组加入不同浓度的样品溶液（质量浓度分别为25、50、100、200、400 μg/mL，取“2.4.1”项下样品母液，用含5%FBS的DMEM高糖培养基稀释而得，质量浓度参考前期预实验设置），每孔100 μL。继续培养24 h 后，按50 μL/孔加入1 mg/mL 的MTT溶液;继续培养4 h 后，弃去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，采用酶标仪于490 nm 波长下检测各孔的吸光度（A）值，并按下式计算细胞存活率（%）：细胞存活率（%）=（A 给药组/A 空白对照组）×100%。结果显示，经25～400 μg/mL的提取物作用24 h 后，各给药组细胞的平均存活率均大于97%，表明各质量浓度的条芩和枯芩提取物对细胞均无毒性，详见表3。

2.4.3 NO抑制率的测定取对数生长期的RAW264.7细胞，按1.0×106个/mL接种于96 孔板中，培养24 h 后，弃去上清液。将细胞分为空白对照组、LPS 模型组和给药组，每组设置4 个复孔。空白对照组加入含5%FBS 的DMEM高糖培养基，LPS模型组加入含500 ng/mL LPS、5%FBS 的DMEM高糖培养基[15]，给药组加入50 μg/mL样品溶液（质量浓度根据前期预实验和“2.4.2”项下实验结果设置），每孔100 μL。继续培养24 h 后，取每孔上清液50 μL，接种至新的96 孔板中，根据NO检测试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪于540 nm波长下检测各孔的A 值，采用格里斯法计算NO含量并根据标准曲线计算NO释放量，再按下式计算NO抑制率：NO抑制率（%）=（NO释放量LPS 模型组-NO释放量给药组）/NO 释放量LPS 模型组×100%。采用GraphPad Prism 8.0 软件进行分析，数据均以x ± s 表示，采用t 检验，检验水准α =0.05。采用GraphPad Prism 8.0 软件计算各样品的半数有效浓度（median effective concentration，EC50）。

测定结果显示，50 μg/mL 枯芩提取物的NO抑制率为62.14%～71.13%，条芩提取物为39.52%～50.19%，前者的平均值显著高于后者（P<0.05）;枯芩提取物的EC50为18.81～34.10 μg/mL，条芩提取物为46.67～68.34μg/mL，前者的平均值显著低于后者（P<0.05）。结果见表4。

2.4.4 IL-6、IL-1 β 抑制率的测定取对数生长期的RAW264.7 细胞，按1.0×106个/mL 接种于96 孔板中，培养24 h 后，弃去上清液。将细胞分为空白对照组、LPS模型组和给药组，每组设置4 个复孔。空白对照组加入含5%FBS 的DMEM 高糖培养基，LPS 模型组加入含500 ng/mL LPS、5%FBS 的DMEM高糖培养基[15]，给药组加入50 μg/mL的样品溶液（质量浓度根据前期预实验和“2.4.2”项下实验结果设置），每孔100 μL。继续培养24 h 后，取每孔上清液30 μL，根据ELISA试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪于470 nm 波长下检测各孔的A值，根据标准曲线计算IL-6、IL-1β的释放量，并按下式计算IL-6 或IL-1β的抑制率（%）：抑制率（%）=（IL-6 或IL-1β释放量LPS 模型组-IL-6 或IL-1β释放量给药组）/IL-6 或IL-1β释放量LPS模型组×100%。统计学方法同“2.4.3”项。

测定结果显示，50 μg/mL 枯芩提取物对IL-6、IL-1β的抑制率分别为3.32%～18.38%、93.12%～95.47%，条芩提取物分别为6.21%～22.55%、94.10%～96.44%;其中枯芩提取物的平均IL-6 抑制率显著低于条芩提取物（P<0.05），而枯芩与条芩提取物的平均IL-1β抑制率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表4。

2.5 灰色关联分析2.5.1 原始数据的无量纲化处理由于原始数据数列单位或量纲不同，不便于比较，因此在进行灰色关联分析前需要对数据进行无量纲化处理。本研究采用均值变换法，即用各序列元素分别除以相应序列平均值。将NO、IL-6、IL-1β抑制率均值化处理后的数据设为参考序列Y（k）（k=1、2、3…10，为样品编号），15 个共有峰峰面积均值化处理后的数据设为比较序列Xi（k）（i=1、2、3…15，为共有峰峰号），按下式计算绝对差序列Δi（k）：Δi（k）=|Y（k）-Xi（k）|[16]。

2.5.2 关联系数的计算对于参考序列Y（k）有若干个比较序列Xi（k），绝对差序列中的最小值与最大值分别记为Δ（min）、Δ（max）;ρ为分辨系数，一般为0～1，通常取0.5;按下式计算关联系数ξi（k）：ξi（k）=[Δ（min）+ρ×Δ（max）]/[Δi（k）+ρ×Δ（max）]。本研究中，参考序列为NO 抑制率时，Δ（min）=0.001 3，Δ（max）=1.782 5;参考序列为IL-6 抑制率时，Δ（min）=0.033 8，Δ（max）=2.639 8;参考序列为IL-1β抑制率时，Δ（min）=0.001 3，Δ（max）=1.971 7。

2.5.3 关联度的计算关联度（r）为各类关联系数的平均值，按下式计算：r=1nΣk=1nξi（k）（式中，n 表示比较序列的数据个数）[16-17];当r≥0.9 时，表示子序列对母序列有显著影响;当0.8≤r<0.9 时，表示有相对显著影响;当0.7≤r<0.8 时，表示有明显影响;当0.6≤r<0.7 时，表示有较小影响[18]。结果显示，条芩与枯芩提取物中15 个共有峰与各炎症因子抑制率的关联度均大于0.6;与NO抑制率的关联度由大到小依次为峰3>峰2>峰7>峰6>峰10>峰5>峰11>峰8>峰14>峰9>峰4>峰1>峰15>峰13>峰12，与IL-6 抑制率的关联度由大到小依次为峰9>峰8>峰5>峰7>峰2>峰6>峰1>峰3>峰10>峰11>峰14>峰4>峰15>峰13>峰12，与IL-1β抑制率的关联度由大到小依次为峰5>峰9>峰2>峰8>峰7>峰3>峰6>峰1>峰10>峰14>峰11>峰4>峰13>峰15>峰12。其中，峰2～3、5～8、10～11 与NO抑制率的关联度均大于0.8;峰2、5、8～9 与IL-1β抑制率的关联度均大于0.9;各峰与IL-6 抑制率的关联度均小于0.8。由于条芩和枯芩提取物对IL-6 的抑制率均较低，对NO、IL-1β的抑制率均较高，初步确定峰2～3、5～11 为黄芩抗炎活性的主要成分;同时，结合“2.3”项下结果，初步确定峰6、10～11 为造成条芩与枯芩抗炎活性差异的主要化学成分。结果见表5。

2.6 聚类分析

以50 μg/mL 浓度下各组细胞的NO、IL-1β、IL-6 抑制率为指标，利用平方欧氏距离为测度，采用SPSS 26.0软件进行聚类分析。结果显示，当平方欧氏距离为25时，10 批样品可聚为2 类，K1～K5 为一类，T12～T16 为一类，表明可将NO、IL-1β、IL-6 抑制率作为区分条芩与枯芩的指标。结果见图5。

3 讨论

本研究建立了5 批条芩和5 批枯芩的HPLC指纹图谱，确定了15 个共有峰，相似度均大于0.990，表明指纹图谱不能区分条芩和枯芩。PCA结果显示，条芩与枯芩分别位于得分图的两侧，其中条芩的聚集程度较高，枯芩则较分散，提示该法可区分条芩和枯芩。同时，推测枯芩较为分散的原因可能与采收年限的不同有关。OPLS-DA结果显示，有8个峰的VIP值>1，表明这8个峰对应的成分可能是影响条芩和枯芩质量的差异标志物。

由于NO是氧化应激反应的主要介质，而氧化应激能参与并加剧炎症反应;肿瘤坏死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6 是由巨噬细胞产生的促炎性细胞因子，可介导炎症反应的发生;NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 是学者们关注较多的炎症因子[19]，加之本课题组前期研究发现，在50 μg/mL 质量浓度下，条芩和枯芩提取物对TNF-α无明显的抑制作用，但对IL-1β的抑制作用显著，虽然条芩和枯芩提取物对IL-6 的抑制作用较弱，但组间比较仍有显著的差异性，故综合考虑，選择NO、IL-1β、IL-6 作为评价条芩和枯芩抗炎活性差异的指标。

本研究结果显示，各给药组的NO抑制率、IL-6 抑制率差异显著，两种提取物对IL-1β的抑制率均较高。为在相同质量浓度下比较提取物对各炎症因子的抑制率，故仅对50 μg/mL 提取物对应的数据进行比较。结果显示，在50 μg/mL 质量浓度下，枯芩提取物的平均NO抑制率显著高于条芩提取物，平均EC50、平均IL-6 抑制率均显著低于条芩提取物;两种提取物对IL-1β的抑制率均大于90%。这表明在50 μg/mL 质量浓度下，枯芩提取物对NO的抑制作用较强，但对IL-6 的抑制作用较弱，对IL-1β的抑制作用与条芩提取物相当。

灰色关联分析结果显示，峰2～3、5～8、10～11 与NO抑制率的关联度均大于0.8;峰2、5、8～9 与IL-1β抑制率的关联度均大于0.9;各峰与IL-6 抑制率的关联度均小于0.8。聚类分析结果显示，当平方欧氏距离为25时，10 批样品可聚为2 类，K1～K5 为一类，T12～T16 为一类，表明可将NO、IL-1β、IL-6 抑制率作为区分条芩与枯芩的指标。结合灰色关联分析和OPLS-DA 结果，初步确定峰6、10～11 为条芩和枯芩抗炎活性差异的主要化学成分。这表明黄芩的抗炎活性是多种成分共同作用的结果，该结果可为条芩和枯芩功效差异的进一步研究提供依据。

综上所述，在50 μg/mL 质量浓度下，枯芩提取物对NO的抑制作用较强，但对IL-6的抑制作用较弱，对IL-1β的抑制作用与条芩提取物相当;初步确定峰6、10～11 对应成分是条芩和枯芩抗炎活性差异的主要化学成分。