基于主要活性成分的白子菜叶干燥方式及采收时间研究

武英茹 李媛媛 李宁 郭丁丁 郭福贵 兰子君 赵琳儒 倪艳

关键词白子菜叶;干燥方式;采收时间;水溶性浸出物;总黄酮;多糖;紫云英苷;含量测定

白子菜Gynura divaricata（L.）DC.为菊科菊三七属多年生草本植物，又名鸡菜、白东枫、大肥牛、白背三七、白子草，主要分布于我国浙江、广东、广西、四川、福建及云南等地。其叶味咸、微辛，性寒[1]，于夏、秋两季采收，晒干或晾干。《中药大辞典（上册）》记载，白子菜能清热、舒筋、止血、祛瘀，可治百日咳、风湿痛、骨折、创伤出血、痈肿疮疖等[1]。现代研究表明，白子菜中主要含有黄酮及黄酮苷类、多糖类、生物碱类、挥发油等化学成分[2]，其中黄酮类和多糖类成分具有降血糖、降尿酸、降血脂、抗氧化等药理作用，是其主要活性成分[3-4]。白子菜现被《福建省中药材标准（2006 年版）》收录，但其标准仅有白子菜水分、灰分及总黄酮含量测定项[5]，未见白子菜产地加工的相关描述。产地加工是中药材生产过程中不可缺少的重要环节，可以保障中药材的品质[6]，其相关标准的缺失可能会造成生产过程中有效成分的损失，从而影响药材质量和疗效。

新鲜白子菜叶中水分含量较高（80%～90%），采摘后若不及时干燥或干燥方法不当，则易发生变色或腐烂，从而影响其药用价值和经济价值;此外，对于人工栽培的白子菜，不同的采收时间也可能会影响其质量[7-8]。因此，科学规范的采收应充分考虑药材中有效成分的积累及药材的生长规律。目前，关于白子菜采收时间和干燥方式的研究较少，虽有学者以总黄酮含量为指标对白子菜的采收时间进行了探讨[7]，但除含有黄酮类成分外，多糖类成分也是白子菜的主要活性成分[9]，加之本课题组前期从白子菜50%乙醇提取物中分离得到了紫云英苷，并证实了该成分具有调节血糖、增强免疫力、抗炎、抗氧化等作用[10-12]，故仅以总黄酮为指标进行研究尚不够全面。基于此，本研究采用2020 年版《中国药典》（四部）通则“热浸法”测定白子菜叶中的水溶性浸出物，采用紫外-可见分光光度法测定其中总黄酮及多糖的含量，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定其中紫云英苷的含量，并以这些主要活性成分含量为指标，筛选白子菜叶的最优干燥方式及采收时间，旨在为规范其产地加工及控制其质量提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有UltiMate 3000 型HPLC 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），1100 型HPLC 仪（美国Agilent 公司），SE402F 型十万分之一电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]，FW-100 型高速万能粉碎机、HH-1 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司），DZF-6050 型真空干燥箱（南京沃环科技实业有限公司），U-1901 型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），LC-300B 型数控超声波清洗仪（ 山东济宁鲁超超声设备有限公司），EG720KG4-NA 型微波炉（广东美的微波电器制造有限公司），LGJ-S20 型冷冻干燥机（北京四环起航科技有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

D-无水葡萄糖对照品（批号110833-201506，纯度≥99.5%）购自国药集团化学试剂有限公司;芦丁对照品（批号100080-202012，纯度≥91.6%）购自中国食品药品检定研究院;紫云英苷对照品（批号PS011379，纯度≥98.0%）购自成都普思生物科技股份有限公司;硫酸、苯酚、硝酸铝、氢氧化钠、乙腈均为色谱纯，无水乙醇、磷酸均为分析纯，水为超纯水。

8 批白子菜叶（高15～20 cm的地上部分，取白子菜叶）分别于不同时间采自山西省运城市稷山县清河镇稷王农业示范园，经山西省中医药研究院倪艳教授鉴定均为菊科菊三七属多年生草本植物白子菜G. divaricata（L.）DC.的叶。8批白子菜样品的来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 不同干燥方式样品的制备

取白子菜叶样品（编号S1），共7 份，每份50 g，洗净、摊晾8 h 后，分别经阴干、晒干、烘箱干燥（60、70、80 ℃）、微波干燥及冷冻干燥，均干燥至叶质硬而脆且质量恒定。将干燥后的样品粉碎，过40 目筛，备用。不同干燥方式及干燥条件见表2。

2.2 不同采收时间样品的制备

取8 批白子菜叶样品，每份50 g，洗净、摊晾8 h 后，于60 ℃干燥至质量恒定，将干燥后的样品粉碎，过40 目筛，备用。

2.3 水溶性浸出物的測定

参考2020 年版《中国药典》（四部）通则“2201 浸出物测定法”项下“热浸法”测定白子菜叶中的水溶性浸出物[13]：取样品粉末（过50 目筛）2 g，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加水50 mL，密塞，称定质量，静置1 h 后，连接冷凝回流管，加热至沸腾，并保持微沸1 h 后放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液25 mL，置于干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h 后，置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，并按下式计算水溶性浸出物含量（%）：水溶性浸出物含量（%）=[（m2-m0）×50]/（25×m1）×100%（式中，m0为蒸发皿质量，m1为供试品质量，m2为干燥后蒸发皿+供试品质量）。每个样品平行测定3次。

2.4 总黄酮含量的测定

采用紫外-可见分光光度法测定白子菜叶中总黄酮（以芦丁计）的含量。

2.4.1 线性关系考察精密称取芦丁对照品10 mg，加80%乙醇，超声（功率300 W，频率25 kHz，下同）溶解并定容至10 mL，摇匀，即得芦丁质量浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，以80%乙醇定容，静置15 min。以80%乙醇为空白对照，使用紫外-可见分光光度计于510 nm波长处测定吸光度[14]。以芦丁对照品的质量浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）进行线性回归，得芦丁的回归方程为Y=0.478 5X-0.008 5（R 2=0.999 9），表明芦丁检测质量浓度的线性范围为0.008～0.048 mg/mL。

2.4.2 方法学考察（1）取上述芦丁对照品溶液0.5mL，按“2.4.1”项下方法显色后于510 nm 波长处连续测定吸光度6 次。结果显示，芦丁吸光度的RSD为0.02%（n=6），表明仪器精密度良好。（2）取白子菜叶（编号S1）粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加石油醚150 mL，超声30 min，滤过，挥干石油醚，残渣加80%乙醇45 mL，超声30 min，滤过，滤液用80%乙醇定容至50 mL，即得供试品溶液。取上述供试品溶液5.0 mL，置于25 mL 量瓶中，按“2.4.1”项下方法显色后，分别在室温下放置0、10、20、30、40、50、60 min 时于510 nm 波长处测定吸光度。结果显示，芦丁吸光度的RSD 为2.41%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置60 min 内稳定性良好。（3）取上述供试品溶液（编号S1）5.0 mL，共6 份，按“2.4.1”項下方法显色后于510 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品含量。结果显示，芦丁含量的RSD为2.83%（n=6），表明方法重复性良好。（4）精密称取白子菜叶（编号S1）0.5 g，共9 份，分别精密加入一定量的芦丁对照品溶液，按上述方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下方法显色后于510 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率，结果显示，芦丁的平均加样回收率为103.60%（RSD=2.56%，n=9）。

2.4.3 总黄酮含量测定精密称取待测白子菜叶粉末0.5 g，按“2.4.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下方法显色后于510 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品含量。每个样品平行测定3 次。

2.5 多糖含量的测定

采用紫外-可见分光光度法测定白子菜叶中多糖（以D-无水葡萄糖计）的含量。

2.5.1 线性关系考察精密称取D-无水葡萄糖对照品10 mg，加80%乙醇，超声溶解并定容至100 mL，摇匀，即得D-无水葡萄糖质量浓度为0.1 mg/mL 的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL试管中，加水至2 mL，加5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5 mL，摇匀，避光静置15min，取出。以水为空白对照，使用紫外-可见分光光度计于490 nm波长处测定吸光度[14]。以D-无水葡萄糖对照品的质量浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）进行线性回归，得D-无水葡萄糖的回归方程为Y=11.458X+0.003（R 2=0.999 6），表明D-无水葡萄糖检测质量浓度的线性范围为0.01～0.05 mg/mL。

2.5.2 方法学考察（1）取上述D-无水葡萄糖对照品溶液0.4 mL，按“2.5.1”项下方法显色后于490 nm波长处连续测定吸光度6 次。结果显示，D-无水葡萄糖吸光度的RSD为0.02%（n=6），表明仪器精密度良好。（2）取白子菜叶（编号S1）粉末0.5 g，置于锥形瓶中，加80%乙醇100 mL，加热回流1 h，趁热滤过，滤渣和滤器经80%乙醇30 mL分3 次洗涤后移至烧瓶中，加水150 mL，加热回流2 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器，合并滤液及洗液，放冷，用水定容至250 mL，即得供试品溶液。取上述供试品溶液0.5 mL，置于具塞试管中，按“2.5.1”项下方法显色后，分别在室温下放置0、10、20、30、40、50、60min 时于490 nm波长处测定吸光度。结果显示，D-无水葡萄糖吸光度的RSD为2.98%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置60 min 内稳定性良好。（3）取上述供试品溶液（编号S1）0.5 mL，共6 份，按“2.5.1”项下方法显色后于490 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品含量。结果显示，D-无水葡萄糖含量的RSD为3.59%（n=6），表明方法重复性良好。（4）精密称取白子菜叶（编号S1）0.5 g，共9 份，分别精密加入一定量的D-无水葡萄糖对照品溶液，按上述方法制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下方法显色后于490 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率。结果显示，D-无水葡萄糖的平均加样回收率为98.57%（RSD=1.66%，n=9）。

2.5.3 多糖含量测定精密称取待测白子菜叶粉末0.5g，按“2.5.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下方法显色后于490 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品含量。每个样品平行测定3次。

2.6 紫云英苷含量的测定

采用HPLC法测定白子菜叶中紫云英苷的含量。

2.6.1 色谱条件以Diamonsil C18（2）（4.6 mm× 250mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱（0～6.0 min，10%A→17%A;6.0～7.5 min，17%A→27%A;7.5～11.0 min，27%A→90%A;11.0～15.0 min，90%A→17%A）;流速为1.0 mL/min;检测波长为348 nm;柱温为35 ℃;进样量为10 μL。

2.6.2 溶液的制备（1）精密称取紫云英苷对照品5mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，精密移取0.8 mL，用甲醇定容至10 mL，制成紫云英苷质量浓度为0.08 mg/mL 的对照品溶液。（2）取白子菜叶粉末1.0g，精密称定，置于锥形瓶中，加50%乙醇20 mL，称定质量，超声提取30 min，冷却至室温，再次称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，经0.45 μm滤膜滤过，取滤液，即得供试品溶液。（3）以50%乙醇为空白对照溶液。

2.6.3 系统适用性试验精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液，按“2.6.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1 可知，紫云英苷的分离度大于1.5，理论板数按紫云英苷峰计均大于2 500，空白对照溶液对测定无干扰。

2.6.4 线性关系考察精密吸取“2.6.2（1）”项下对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.6.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以紫云英苷对照品的进样量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得紫云英苷的回归方程为Y=35.266X-0.087（R2=0.999 8），表明紫云英苷检测进样量的线性范围为0.08～1.60 μg。

2.6.5 方法学考察（1）精密吸取“2.6.2（1）”项下对照品溶液10 μL，按“2.6.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，紫云英苷峰面积的RSD为0.59%（n=6），表明仪器精密度良好。（2）精密吸取“2.6.2（2）”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h 时按“2.6.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，紫云英苷峰面积的RSD 为1.76%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h 内稳定性良好。（3）精密称取白子菜叶（编号S1）1.0 g，共6份，按“2.6.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.6.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品含量。结果显示，紫云英苷含量的RSD为3.60%（n=6），表明方法重复性良好。（4）精密称取白子菜叶（编号S1）1.0 g，共9 份，分别精密加入一定量的紫云英苷对照品溶液，按“2.6.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.6.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，紫云英苷的平均加样回收率为104.65%（RSD=6.91%，n=9）。

2.6.6 紫云英苷含量测定精密称取待测白子菜叶样品粉末1.0 g，按“2.6.2（2）”项下方法制备供试品溶液，再按“2.6.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品含量。每个样品平行测定3次。

2.7 综合评分的计算

采用层次分析法进行综合评价。本研究构建的两两比较矩阵中，多糖、总黄酮、紫云英苷是发挥临床作用的物质基础，其重要性高于水溶性浸出物;多糖、黄酮类成分的抗氧化、抗炎、增强免疫等作用与白子菜具有的清热凉血、活血止痛功效契合，且总黄酮的作用强于多糖;紫云英苷具有的降血糖、降血脂作用与白子菜的药理作用相对应[15]。故总黄酮、多糖、紫云英苷及水溶性浸出物含量的相对重要性分别记1、3、5、7 分，矩阵结果见表3。

首先，按上述层次分析法计算各指标成分的权重系数及随机一致性比率（consistency ratio，CR）：CR=CI/RI[ 式中，CI（consistency index）为一致性指标，RI（random consistency index）为随机一致性指标]。若CR<0.1，表示矩阵具有满意的一致性，且权重计算正确[15]。

2.8 不同干燥方式对白子菜叶质量的影响

按“2.1”项下方法制备不同干燥方式的白子菜叶样品，记录干燥时间并观察其外观性状，分别按“2.3”“2.4.3”“2.5.3”“2.6.6”项下方法测定样品中水溶性浸出物、总黄酮、多糖、紫云英苷的含量，并按“2.7”项下方法进行综合评价。采用Excel 2010 软件录入数据，利用SPSS 23.0 软件进行方差分析（下同）。

2.8.1 干燥时间及外观性状干燥时间以微波干燥最短，其次为80 ℃烘干，最长为阴干。阴干、微波干燥及冷冻干燥所得白子菜叶均呈深浅不同的绿色，而烘干所得白子菜叶的颜色较深;冷冻干燥所得白子菜叶的叶片平展，最接近鲜叶片，其余干燥方式所得白子菜叶的叶片均存在不同程度皱缩;80 ℃烘干及微波干燥所得白子菜叶有一定香气且具咸味。结果见表4。

2.8.2 含量测定结果水溶性浸出物含量以晒干、微波干燥、冷冻干燥相对较高且3 种方式无明显差异，80 ℃烘干最低;总黄酮含量以微波干燥最高，80 ℃烘干最低，且微波干燥明显高于其他干燥方式;多糖含量以冷冻干燥最高，阴干最低，而冷冻干燥与其他5 种干燥方式（除阴干外）比较均无明显差异;紫云英苷含量以阴干和微波干燥较高，80 ℃烘干最低，且阴干和微波干燥显著高于其他干燥方式。结果见表5。

2.8.3 综合评价按“2.7”项下方法计算得CR为0.043 8（<0.1），总黄酮、多糖、紫云英苷、水溶性浸出物含量的权重系数分别为0.563 8、0.263 4、0.117 8、0.055 0。阴干、晒干、60 ℃烘干、70 ℃烘干、80 ℃烘干、微波干燥、冷冻干燥的综合评分分别为0.811 8、0.855 8、0.629 5、0.546 1、0.492 8、0.996 3、0.665 4 分，提示微波干燥所得白子菜叶的质量较好。

2.9 不同采收时间对白子菜叶质量的影响

按“2.2”项下方法制备不同采收时间的白子菜叶样品，分别按“2.3”“2.4.3”“2.5.3”“2.6.6”项下方法测定样品中水溶性浸出物、总黄酮、多糖、紫云英苷的含量，按“2.7”项下方法进行综合评价。

2.9.1 含量测定结果水溶性浸出物含量由高到低依次为9 月>8 月>3 月>7 月>6 月>4 月>10 月>5 月，总黄酮含量为8 月>6 月>5 月>7 月>9 月>10 月>4月>3 月，多糖含量为8 月>7 月>9 月>6 月>5 月>4月>10 月>3 月，紫云英苷含量为6 月>5 月≈7 月≈9月>8月>4月≈10月>3 月。结果见表6。

2.9.2 综合评价按“2.7”项下方法计算得CR为0.043 8（<0.1），总黄酮、多糖、紫云英苷、水溶性浸出物含量的权重系数分别为0.563 8、0.263 4、0.117 8、0.055 0。3～10 月样品的综合评分分别为0.658 0、0.752 1、0.937 0、0.962 9、0.965 8、0.988 6、0.929 2、0.808 4 分，提示5～9月采收的白子菜叶质量较好。

3 讨论

3.1 实验条件的优化

本课题组前期参考2020 年版《中国药典》（一部）[14]，分别考察了甲醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇等不同提取溶剂及超声、回流提取对白子菜叶中总黄酮提取率的影响，结果显示，当以80%乙醇超声提取时，总黄酮的提取率较高。同时，本课题组参考2020 年版《中国药典》（一部）[14]，对多糖的提取时间进行了考察，结果显示，回流3 h 的多糖提取率较高。此外，本课题组还分别考察了不同色谱柱[AgilentPoroshell SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、DiamonsilC18（2）（4.6 mm× 250 mm，5 μm）] 及不同流动相（乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液），结果显示，以Diamonsil C18（2）为色谱柱、乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，所得色谱峰峰形较好，且待测成分峰周围无杂峰干扰。

3.2 含量测定结果分析

有研究发现，白子菜的水提取物及乙醇提取物具有显著的降血糖作用[3]。总黄酮及多糖是白子菜降血糖、降血脂的主要活性成分[3，17]。本研究结果显示，微波干燥所得白子菜叶中水溶性浸出物、总黄酮、多糖及紫云英苷的含量均较高，且微波干燥的时间顯著短于其他干燥方式;80 ℃烘干所得各成分含量变化有所不同;综合评价结果显示，微波干燥所得白子菜叶的综合评分（0.996 3分）最高，表明此法所得白子菜叶样品质量较好，这与微波干燥有利于保存多糖类、黄酮及黄酮苷类成分的结论一致[18]。8 月采收的白子菜叶中总黄酮、多糖及紫云英苷的含量均较高，3 月采收的白子菜叶中各成分含量均较低，提示不同采收时间样品中各成分含量存在差异;综合评价结果显示，8 月采收白子菜叶的综合评分（0.988 6 分）最高，除3、4、10 月外，其余采收时间白子菜叶的综合评分均大于0.90 分，这与白子菜中总黄酮含量以5～9 月较高一致。

综上所述，微波干燥所得白子菜叶的质量较好，5～9 月采收较优。