代谢组学在奶牛上的应用研究进展

李厅厅，程隽如，曾令湖，于农淇，鄢胜飞，梁莎莎，朱远致，黄健，谭正准，李辉，卢瑛，覃广胜

（1.中国农业科学院广西水牛研究所，农业农村部（广西）水牛遗传与繁殖重点实验室，南宁 530001；2.广西大学，南宁 530001）

1 代谢组学概述

代谢组学是指通过利用多种分析方法对特定生物样品（如血液、唾液、尿液、细胞或组织提取液等）中的小分子代谢物进行定性、定量分析。能够动态地监测由内外因素引起的机体中代谢物的变化，全面系统地研究生物体代谢特征。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科，被誉为组学三部曲的顶点，是系统生物学的重要组成部分[1]。人类基因组由超过25万个基因组成，而这些基因编码了约20万个转录物和超过一百万种蛋白质，相比之下，代谢组仅由约3 000种代谢物组成。这意味着与基因组学和蛋白质组学分析相比，代谢组学分析可以更加快速高效地进行[2]。此外，作为细胞新陈代谢的最终产物，代谢物可能比基因或蛋白质的研究更具信息性。因为机体代谢水平反映的是蛋白质发挥作用之后的下游事件，基因的激活、mRNA表达和蛋白质合成不一定对应改变的细胞功能状态，而代谢水平揭示了生物系统及其细胞的实际功能状态。简单来说，基因组学和蛋白质组学告诉我们可能发生什么，而代谢组学则告诉我们已经发生了什么[3]。

代谢组学分为非靶向代谢组学与靶向代谢组学两个板块。非靶向代谢组学是指无偏向性的对生物样品中所有小分子代谢物同时进行检测，旨在检测出尽可能多的代谢物，从而对机体代谢特征有更加全面的了解。但是它会产生大量的数据，需要进行复杂的生物信息学分析。并且，还受到提取和分析方法等多重因素的影响，只能获得半定量的结果。而靶向代谢组学是分析特定的某一类代谢物，特别针对一种或几种途径的代谢产物，通过制备目标代谢物浓度范围的标准曲线获得准确的定量结果。相比之下，靶向代谢组学比非靶向代谢组学具有更高的灵敏度和特异性，可用以验证和扩展非靶向分析的结果。

代谢组学发展至今虽只有将近20年的历史，但目前已经成为现代科学的研究热点，2008年首次出现在奶牛上的应用报道[4]。代谢组学技术最初着眼于生物标志物的发现，通过检测特定生理状态（各种疾病、药物处理和环境暴露等）下的代谢表型变化，从而筛选出生物标志物。最近几年，代谢组学迅速发展，由于信息学和分析技术的创新发展以及正交生物学方法的整合，已能够了解代谢物在系统水平上的作用，帮助研究人员更加全面深入地洞察各种生理条件或异常过程的潜在发展机制[5]。

2 代谢组学在奶牛上的应用

2.1 代谢组学在奶牛疾病中的应用

代谢组学技术可以全面了解奶牛疾病的发生和发展过程，准确检测出参与疾病发生的代谢物和代谢通路，从而帮助进一步针对性地研究其预防和治疗方案。目前代谢组学技术在奶牛疾病中的研究主要集中在腐蹄病、营养代谢疾病和繁殖障碍疾病这几个方面。

随着奶牛养殖的集约化发展，腐蹄病已经成为危害奶牛养殖业的三大普通病之一，特别在我国南方、中部省份的高温高湿季节多发。奶牛代谢病为高产奶牛多发病，当日粮营养物质供给及其代谢过程的某些方面或某一环节发生问题导致代谢机能发生障碍而引起[6]。奶牛常见的营养代谢病例如酮病、低钙血症、脂肪肝、产乳热、犊牛血红蛋白尿症等[7]，营养代谢病发病缓慢，呈慢性消耗，发病率较高并且早期诊断困难。所以代谢组学技术在奶牛营养代谢疾病的早期诊断及病因分析上占据一席之地。奶牛繁殖障碍疾病位居奶牛三大常见病之首[8]，患病率在20%～40%，是导致奶牛过早淘汰的主要因素。表1列举了近年来代谢组学技术在奶牛疾病进行研究，发现大量可用于定性的疾病相关生物标志物。可以看出，利用代谢组学技术对奶牛疾病定性出大量与疾病相关的生物标志物。可以预见，该项技术有望在奶牛的疾病诊断、治疗检测和病理研究方面施展拳脚。

表1 代谢组学在奶牛疾病方面的研究

2.2 代谢组学在奶牛营养中的应用

代谢组学在奶牛营养上研究主要在奶牛健康以及改善乳品质这两个方面。奶牛围产前期由于胎儿对瘤胃的机械性压迫导致瘤胃容积变小，并且在生殖激素、瘦素、神经肽等代谢信号的作用下导致奶牛干物质的采食量下降，所以无法满足胎儿发育和产后泌乳的能量需求[18]。由于能量输出加剧和干物质采食量不足，极易造成奶牛能量负平衡（negative energy balance,NEB），NEB诱发的糖脂代谢异常是围产期奶牛面临的主要问题[19]。因此，关于围产期奶牛营养调控的研究从未停止。

围产期奶牛饲粮中补充叶酸有利于提高奶牛产奶量，由于叶酸能补充调节免疫和乳腺炎的相关基因，因此，Khan[20]等建议将叶酸用于围产期奶牛乳腺炎的防治研究。Wei[21]等采用GC-TOF/MS对饲粮中添加生物素（Biotin，BIO）和烟酰胺（Nicotinamide，NAM）的围产期奶牛血清代谢谱进行研究，结果表明添加BIO和NAM均可促进氨基酸代谢，而添加NAM能通过降低围产期奶牛不饱和脂肪酸的合成而降低血液脂肪酸含量，并且对缓解围产期奶牛氧化应激有重要作用。Yang[22]等对泌乳期间饲粮中添加共轭亚油酸（Conjugate Linoleic Acids，sCLA）的奶牛肌肉和血清中的代谢组学进行了分析，发现补充CLA可导致肌肉和血清甘油磷脂、鞘磷脂浓度发生变化。Xu[23]等通过LC-QQQ-MS检测NEB状态下奶牛泌乳早期的牛奶代谢谱，利用代谢组学数据与能量平衡相关的前15个最相关变量，建立能量平衡正向选择回归的简化线性模型，结果表明乳脂产量、甘氨酸、胆碱和肉碱是估计能量平衡的重要变量。Sun[24]等通过GC-TOF/MS对饲喂苜蓿干草和玉米秸秆的泌乳奶牛瘤胃液、牛奶、血清和尿液的代谢组学分析表明，两种营养条件下的代谢产物和代谢途径发生了显著变化，并且饲喂玉米秸秆奶牛的氮利用率较低。Wang[25]等通过代谢组学和转录组学研究娟珊牛和荷斯坦牛高、低剩余采食量（Residual feed intake，RFI）背后的代谢机制，得到3个重要的代谢途径并在基因-代谢物相互作用网络中鉴定出一个与两种代谢物（-α-酮戊二酸和琥珀酸）相关的基因（2-hydroxyacyl-CoA lyase 1(+HACL1)），为高RFI和低RFI荷斯坦牛和娟珊牛提供了新的代谢途径和代谢-基因表达谱。

奶牛的健康状况直接影响其产奶性能，利用代谢组学方法研究奶牛在饲粮调控下的牛奶化学成分变化是乳品质改善的研究思路之一。Rocchetti[26]等研究奶牛食用霉菌毒素污染的玉米青贮饲料对牛奶代谢谱的影响，结果表明，抗氧化分子（谷胱甘肽）在牛奶样品中大量积累，原因可能是奶牛饲粮中霉菌毒素引起机体的氧化应激而造成。由于奶牛自然放牧的饲养方式更加符合动物福利的要求，放牧的奶源比TMR舍饲的奶源更加受到消费者的青睐，因此，Callaghan[27]等采用1H NMR非靶向代谢组学分析放牧（多年生黑麦草、白三叶）和TMR舍饲的奶牛瘤胃和牛奶代谢谱，结果显示马尿酸在放牧饲养奶牛的牛奶中浓度显著升高，所以马尿酸可以作为不同牧草来源牛奶的潜在生物标志物。乳脂率低综合征（Mlik fat depression，MFD）严重影响牛奶品质。Zeng[28]研究在饲粮调控下奶牛瘤胃代谢组-微生物组相互作用对奶牛MFD的影响，结果表明颗粒型高淀粉TMR饲粮缩短奶牛反刍时间，改变了瘤胃发酵类型，导致瘤胃微生物区系和代谢产物组成发生变化，引起MFD。虽然高谷物的TMR饲粮有利于改善奶牛围产期的NEB，但是也会引发一些副作用，所以奶牛围产期的精细化饲养管理尤为重要。

2.3 代谢组学在奶牛生产中的应用

短期热应激对荷斯坦牛的血液代谢物以及生理状态（直肠温度、心率）和牛奶的miRNA表达有负面影响[29]。Gu[30]等采用血清代谢组学方法研究了慢性热应激条件下荷斯坦牛和杂交水牛的耐热差异，生理指标和血清代谢谱均表明，杂交水牛比荷斯坦牛的耐热性更强，这为热带和亚热带地区水牛奶业的发展提供了可行性。Wang[31]等利用非靶向液相色谱-质谱代谢组学方法研究不同体况评分（BCS）的产犊奶牛血浆代谢图谱，鉴定出7个重要的差异代谢物，包括6个不同的LysoPCs和1个PE，此外，这7种代谢物与奶牛的脂质代谢、炎症和过度肥胖（HBCS）密切相关。王世成[5]等建立了高效液相色谱-质谱技术研究牛奶代谢组学方法，研究了注射氯霉素后牛奶的内源性代谢物的变化，结果显示，单羟基十八碳二烯酸（HODE）可作为注射氯霉素后奶牛体内代谢应激产生的内源性生物标志物。罗芳[32]等利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-QTOF MS）技术筛选表征奶牛产后异食沙土的生物标志物，从奶牛（n=29,T=13、C=16）血浆中表征出11种生物标志物，为研究奶牛产后异食沙土的预防提供了新的方法和思路。代谢组学方法还用于鉴定合成和半合成激素的非法使用，这些代谢图谱可为牛雌二醇及其衍生物给药或黄体酮给药提供依据，在后续的试验中阐明了这种潜在的生物标志物的结构为二肽[33,34]。

此外，代谢组学在乳品质量控制及其营养价值评估方面也表现出良好的适用性[35]，Wu[36]等利用GC-TOF/MS和超高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）平台鉴定出与经产荷斯坦牛产奶量和乳蛋白相关的差异代谢物，其中马尿酸、烟酰胺和壬二酸可能是与奶牛产奶相关的关键代谢物。Pu[37]等利用非靶向和靶向代谢组学分析了云南省不同海拔对水牛奶乳清中的差异代谢物的影响并进行了评价，得出在低海拔（912m）地区的水牛奶的生物功能成分丰富，更适合生产氨基酸、维生素B6和碳水化合物含量较高的功能性乳品，而在高海拔（1865m）地区的水牛奶则适合作为生产游离脂肪酸含量高的乳制品原料乳。Xue[38]等通过瘤胃宏基因组学和代谢组学，并结合血清代谢组学分析乳蛋白产量（Milk Protein yield,MPY）在瘤胃微生物和宿主水平上的潜在调控机制，同时利用瘤胃代谢组学进行表型（MPY）关联分析，为精确喂养改善牛奶质量和产量的研究提供了新思路。

2.4 代谢组学在奶牛繁殖中的应用

代谢组学在奶牛繁殖领域的应用也有报道，目前主要应用于对公牛繁殖效率和精液质量的评估。Kumar[39]通过质子核磁共振在奶牛精浆和血液中各鉴定出4种代谢物，用作公牛繁殖力的生物标记。同样，奶牛精子代谢组学研究发现22种不同代谢物和4个代谢途径与公牛生育力有关。Velho[40]研究得出精浆代谢物2-氧戊二酸和果糖可作为公牛繁殖力的潜在生物标记。在实际生产中，如何用最简便的方法评估精液质量始终是一个问题。Argaman[41]采集了荷斯坦公牛冬夏两季精液精子，使用精子质量分析仪评估精液的生理和结构特征，通过气相色谱鉴定及定量精液脂质成分，结果表明，夏季高温导致精液质量变差，脂质成分改变，包括饱和脂肪酸增高，不饱和脂肪酸、胆固醇降低。鉴于精液质量和脂质变化的强相关性，他们建议使用脂类成分来预测精液质量。

相较于雄性动物，雌性动物代谢组学的应用更为广泛，Bender[42]等人发现牛卵泡液中较高水平短链脂肪酸（SFA）可能是泌乳母牛生育力低于青年母牛的原因。而在奶牛卵泡液中，高生育力奶牛含有更多的不饱和脂肪酸，低生育力奶牛饱和脂肪酸含量更高。随着研究的深入，代谢组学还用于奶牛卵泡发育、卵母细胞和胚胎质量评估、胚胎性别鉴定等。李迪[43]利用SVM成功建立水牛胚胎发育潜能预测模型，成功预测率达到100%，在指导挑选高质量的胚胎和提高胚胎移植成功率上有较大的价值，有待推广利用。Matoba[44]认为L-丙氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸和尿素可作为评估牛卵母细胞发育潜能的标志物。Gimeno[45]尝试从体外培养胚胎的培养基中利用UHPLC-MS/MS预测受体妊娠和胎儿出生的潜能，发现易怀孕的胚胎消耗更多氨基酸和柠檬酸，消耗较少的脂质和顺乌头酸。Rubessa[46]运用代谢组学技术表明，植入前的胚胎代谢可显示出与胚胎性别相关的特征，他们使用了一种新的、非侵入性的方法来评估移植前胚胎的性别，发现在胚胎培养的早期阶段，培养基缬氨酸浓度是良好的指标（准确度为66.7%），而在后期阶段，丙酮酸耗竭是评估胚胎性别的最佳标志物（准确度为64%）。IVF、ET技术对于提高母畜繁殖效率尤为重要，而基于代谢组学的研究信息为其进一步发展提供了重要依据。

3 总结与展望

代谢组学技术在奶牛上的应用主要是：生物标志物筛选和生物机制发现两个方面，在奶牛疾病预测、营养调控、繁殖和生产管理上均有涉及，而且为了更深入地了解生物机制，近几年还出现了奶牛多组学的研究。但是在确定生物学过程背后的关键调控机制及其在奶牛生产性能、福利和健康中的作用方面仍有待进一步深入研究。多组学与其他“大数据”的结合（例如将使用与互联网通信的远程传感器测量的生理和行为数据用于监测奶牛发情、跛足或反刍）应该成为未来奶牛的代谢组学发展趋势。