针刺对抑郁大鼠单胺类神经递质相关基因表达的影响

徐雪娇，李天英，李 欣，乔延盈，刘俊麟，田家华，何秀丽

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

随着工作和生活压力的不断增加，越来越多的人处于焦虑抑郁状态，长期持续的焦虑抑郁状态导致各种疾病的发生率显著增高，严重影响人类的生命健康。随之而来抑郁症的发病率也呈爆发式增长，分布在各个年龄段，给家庭和社会带来沉重的负担。抑郁症的病因是由遗传和环境等多因素共同作用的结果。在众多抑郁症的发病机制中，经典单胺类假说一直被大家认可[1-2]，大量研究表明抑郁症的发病存在单胺类神经递质紊乱的现象[3-4]，抑郁症治疗的相关研究表明抗抑郁药物对单胺类神经递质具有调节作用[5-7]。针刺四神聪治疗抑郁症具有疗效确切、依从性好且副作用小的优势[8-9]。笔者采用的抑郁模型为束缚抑郁模型，其模拟人类在日常生活中肉体和精神受到的持续束缚[10]，导致抑郁症的发生。本研究针刺四神聪治疗束缚抑郁模型大鼠，观察针刺对行为学及海马单胺类神经递质相关基因的表达影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验选用雄性SD大鼠，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证编号：SCXK(黑)2018-003，所有大鼠饲养环境及饮食水均相同，符合啮齿类动物饲养标准。

1.2 实验及造模流程

将18只雄性SD大鼠随机分为3组，对照组、束缚组和束缚+针刺组各6只。大鼠进入实验室后首先适应性喂养7 d，提供标准的实验动物饲养环境、饮食和饮水。适应性喂养结束后，第8天进行糖水基线测定，第9天进行旷野实验。第10～30天进行抑郁造模。大鼠每天固定时间进行束缚。具体束缚方法为[11]：每天9—15时将大鼠放置在塑料束缚容器中，连续束缚21 d。束缚结束后，第31天进行糖水消耗实验，第32天进行旷野实验。然后开始针刺治疗14 d，针刺结束后第47天糖水消耗实验，第48天进行旷野实验。第49天取材。见图1。

1.3 行为学

1.3.1 糖水消耗 取两个大小外形完全一致的饮水瓶，其中一瓶装纯水，另一瓶装2 %浓度糖水。检测2 h大鼠的糖水消耗值，即糖水饮用量/糖水+纯水饮用量[12-13]。糖水消耗实验前6 h禁水，糖水消耗实验过程中禁食。见图2。

1.3.2 旷野实验 大鼠依次进行旷野实验，每只大鼠放置于相同的位置，且上一只实验完毕后及时清理排泄物及旷野箱中的气味，以保证放入大鼠不受到上只大鼠排泄物及气味的影响[14]。大鼠放置于旷野箱(100 cm×100 cm×40 cm)后，适应30 s后再进行追踪器(SMART, Panlab SL, Barcelona, Spain)拍摄。拍摄数据为5 min运动距离和中心范围运动时间。记录过程中保证大鼠在旷野箱内活动，若爬出旷野箱则此次记录失败。见图3。

1.4 针刺

使用一次性无菌针灸针(0.18 mm×13 mm，华佗针具，苏州医疗用品厂有限公司)针刺四神聪[15-16]，操作前使用酒精棉球消毒穴位，刺入深度约5～6 mm，留针15 min。

1.5 取材

麻醉后即刻断头取脑，将脑组织放置于冰盘上，迅速剥离海马组织。见图4。放置于冻存管内，做好编号标记，超低温冰箱(-80 ℃)保存。

1.6 单胺神经递质芯片

进行RNA提取和实时PCR微阵列程序。大鼠海马组织提取RNA样品，所有实验均使用独立的样品进行了3次。使用Trizol提取规程(Invitrogen，CA)提取总RNA，然后通过RNeasy®MinEluteTMCleanup Kit(Qiagen，Valencia，CA)纯化。RNA浓度和纯度通过NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，威尔明顿，DE)进行定量。使用SuperScript Ⅲ反转录酶(Invitrogen)对总RNA进行反转录，并使用2X Super Array PCR Master Mix(SuperArray Bioscience，Frederick，MD)通过PCR扩增互补DNA。使用大鼠多巴胺和5-羟色胺途径PCR阵列(目录号PAMM-158z，SuperArray Bioscience)以及大鼠GABA和谷氨酸PCR阵列(目录号PAMM)测量样品的基因表达。目录号PAMM-152z，SuperArray Bioscience。使用△△Ct方法(表示为倍数变化)和Student’st检验对获取的数据进行分析。

1.7 数据统计学处理

采用SPSS 24.0软件，根据数据是否符合正态分布选择t检验或非参数检验。当P<0.05时被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学结果

2.1.1 糖水消耗结果 第8天，糖水基线测定，3组大鼠糖水消耗无差异。第31天，束缚造模结束后，束缚组和束缚+针刺组大鼠的糖水消耗值与对照组比较显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明束缚抑郁模型造模成功。针刺治疗结束后，第47天，束缚+针刺组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，与束缚组比较，糖水消耗显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01),说明针刺可以逆转束缚大鼠的欣快感缺失症状。见表1。

表1 糖水消耗

2.1.2 旷野实验结果 整个实验中，3组大鼠的旷野运动总距离无差异,说明3组大鼠运动能力无差异。旷野中心运动时间，束缚造模后，与对照组相比，束缚大鼠的中心运动时间显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01),说明束缚抑郁模型成功建立。针刺结束后，与束缚组相比，束缚+针刺组大鼠中心运动时间显著增加，差异具有统计学意义(P<0.01),说明针刺可以逆转束缚大鼠的抑郁样行为。见表2。

表2 旷野实验中心运动时间

2.2 芯片结果

2.2.1 芯片检测结果 系统地检测了3组大鼠海马中单胺类神经递质相关基因表达。见表3。总共鉴定出16个差异表达的基因。与对照组大鼠相比，束缚大鼠以下物质上调：磷脂酶A2组V(Pla2g5)，CAMP反应元件结合蛋白1(Creb1)，糖原合酶激酶3α(Gsk3a)，单胺氧化酶B(Maob)，磷脂酰肌醇3激酶催化α多肽(Pik3ca)，溶质载体家族18(囊泡单胺)成员1(Slc18a1)，多巴脱羧酶(Ddc)，5-羟色胺(5-羟色胺)受体3B(Htr3b)，钙离子通道依赖电压的N型α1B亚基(Cacna1b)，3-磷酸甘油酸脱氢酶(Phgdh)，溶质载体家族17(钠依赖性无机磷酸盐共转运蛋白)8(Slc17a8)，A受体亚基alpha 6(Gabra6)和γ-氨基丁酸(GABA)C受体亚基rho 1(Gabrr1)。束缚大鼠的核受体亚家族4组A成员1(Nr4a1)，G蛋白偶联受体激酶6(Grk6)和白介素1 beta(L11b)下调。与对照组相比，针刺后以下基因发生逆转：Creb1，Gsk3a，Pla2g5，Cacna1b，Nr4a1。这些发现表明针刺在治疗抑郁症的同时影响海马单胺神经递质相关基因的表达。

表3 单胺类神经递质在各组中的表达

2.2.2 逆转基因参与相关通路分析 应用KEGG Mapper在线程序，搜索针刺后逆转的5个基因所属通路。主要参与多巴胺能突触和胆碱能突触途径。见图5～6。其中粉色标注为逆转基因及相关基因。以上两个通路是研究抑郁症的发病和治疗的热点。

3 讨论

四神聪为经外奇穴，位于巅顶百会穴前后左右各旁开1寸，共4穴。《针灸资生经》记载：“神聪四穴，在百会四面各相去一寸。理头风目眩，狂乱风痫，左主如花，右主如果。针三分。”四神聪所在位置与督脉和膀胱经关系密切，督脉入络脑，膀胱经从巅顶入络脑，故具良好的醒神通窍、聪耳明目和宁心安神的功效。主治癫狂、痫证、失眠、健忘和头晕头痛等病症。抑郁症属于中医范围的“癫证”，以情绪低落、欲望减低等负面情绪占主导。临床上常应用四神聪穴搭配电针或中药联合治疗抑郁症[17-18]，疗效肯定，值得推广使用。作为仅以疼痛为副作用的治疗方法，针刺治疗抑郁症具有疗效好、患者易于接受的特点。鉴于目前临床上针刺治疗抑郁症的疗效，针刺有望取代西药而作为其主要治疗手段。抑郁症的发病有以下几个观点：遗传因素、单胺假说、受体假说、神经内分泌假说、神经可塑性假说、细胞因子假说和社会文化及心理因素[19-20]。单胺假说是目前比较公认的抑郁症病因假说，此观点认为抑郁症的发生是由于中枢单胺类神经递质含量和功能水平下降导致。临床上的一类抗抑郁药物即为作用在单胺类神经突触，增加神经递质的释放而抗抑郁。本实验探讨针刺四神聪对抑郁大鼠海马单胺类神经递质相关的基因水平的调节作用，从基因的角度解释针刺对单胺类神经递质的调节作用。

本研究结果中，行为学显示针刺四神聪能够逆转束缚后抑郁大鼠的欣快感和抑郁样行为。验证四神聪能够有效抗抑郁。单胺类神经递质芯片检测结果显示针刺可以逆转抑郁大鼠以下基因：CAMP反应元件结合蛋白1(Creb1)，糖原合酶激酶3α(Gsk3a)，磷脂酶A2组V(Pla2g5)，钙离子通道依赖电压的N型α1B亚基(Cacna1b)，核受体亚家族4组A成员1(Nr4a1)。通路关联分析显示，逆转的基因主要参与多巴胺能突触和胆碱能突触途径。这5个基因归属于3类功能：参与神经递质途径的基因(Creb1，Gsk3a，Pla2g5)、突触基因(Cacna1b)、多巴胺和5-羟色胺基因靶标中涉及的基因(Nr4a1)。这3类基因主要参与调节神经递质，突触相关基因以及多巴胺和5-羟色胺。多巴胺为中枢神经系统兴奋性神经递质，五羟色胺则为抑制型神经递质，Nr4a1参与两者的调节，参与完成中枢神经系统神经递质的相对平衡。单胺类神经递质系统在调节脑功能和行为方面具有关键作用。Creb与抑郁症、精神分裂症和成瘾等疾病密切相关，作为第二信使信号转导中的重要组分，在神经的可塑性等方面发挥重要作用，一些亚型破坏后会影响认知功能[21-22]。其对神经元的保护作用主要体现在对抗细胞毒性和调节神经营养物质。Gsk3广泛存在于中枢神经系统，包括两个亚型：GSK3a和GSK3β，其中Gsk3a主要存在于海马和皮层[23]。睡眠障碍是抑郁症患者常见的伴随症状，有研究表明GSK3抑制剂锂对抑郁症患者的睡眠具有改善作用[24]。本研究证实针刺四神聪治疗抑郁症疗效确切且调节单胺类神经递质相关基因表达，为抑郁症的针刺治疗在单胺类神经递质调节上提供基因层面的证据。