新型磷霉素壳寡糖盐的抑菌活性研究

姜志炜，韩新才*，祝 宏，刘 慧，史凯丽，李睿媛，马 峻

1.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205；

2.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205；

3.武汉市金银潭医院，湖北 武汉 430023

磷霉素（fosfomycin，通常指左旋磷霉素）是一种在临床上常用的重要广谱抗生素［1］，它具有独特的杀菌作用，能抑制细菌细胞壁的合成［2］，进而达到杀死细菌的目的，且不易产生耐药性，临床上具有广泛的应用［3］。由于磷霉素对细胞壁合成的破坏，可以使其他药物进入到细菌体内，进而产生协同作用［4］，且磷霉素具有良好的口服生物利用度，低毒、安全，具有较好的承受性［5-6］。壳寡糖（chitosan oligosaccharide）主要来源于甲壳素［7-8］，是公认的低分子量水溶性壳聚糖，其生物活性高于壳聚糖，具备带正电荷、呈碱性、易溶于水［9］等特点，能抗菌、抗肿瘤［10］等，具有优越的生物活性［11］。它的化学结构与磷霉素呈现互补特征，二者的相互结合，在抵抗感染方面能够具有一定的协同效应。通过在磷霉素的合成工艺上进行优化，进而制备出新型磷霉素-壳寡糖盐（fosfomycin chitosan oligosaccharide salt，FCOS），可以为磷霉素家族增添新的成员。磷霉素壳寡糖盐于磷霉素类抗菌药而言，具有重要的研究意义，应对当下临床上的“超级细菌”，磷霉素壳寡糖盐具有很大的潜力。另外，区别于市面上现有的磷霉素盐，磷霉素壳寡糖盐可以作为一种新的药物，具有较好的开发应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SW-CJ-1FD 单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；DNP-9082 电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；YXQ-SG41-280-A 手提式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；THZ-C 恒温振荡器（太仓市实验设备厂）；

磷霉素壳寡糖盐（实验室自制）；磷霉素钙（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180718），牛肉浸膏（生物试剂，上海博微生物科技有限公司，批号：190514）；蛋白胨（生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20191116）；硫酸H2SO4（分析纯，西陇科学股份有限公司，批号：170810）；氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20170608）；氯化钡（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20180615）；蒸馏水。

1.2 实验菌株

大肠杆菌ATCC35218（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌ATCC700607（Κlebsiella Pneumoniae）、铜绿假单胞菌ATCC27853（Pseudomonas aeruginosa），由武汉市金银潭医院提供；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（临床分离株）（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、沙 门 氏 菌CICC21482（Salmonella enteriditis），由武汉工程大学实验室保存。

1.3 待测新型磷霉素盐的理化性质

本实验所使用的新型磷霉素壳寡糖盐由武汉工程大学实验室参照相关文献［12-13］并做适当修改，化学合成的新型抗菌产品，其结构式如图1 所示。由于提取终产物时的溶液pH 值各有不同，导致最终产品性状有所差异，因此本实验选择新合成的5 批样品进行病原菌抑菌作用测试，5 批产品性状如表1 所示。

图1 磷霉素壳寡糖盐的结构式Fig.1 Structure of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt

表1 五批样品性状Tab.1 Sample characteristics of five batches

1.4 方 法

以微量肉汤稀释法测定新型磷霉素壳寡糖盐对5 种病原菌的抑菌活性；在-20 ℃冰箱及常温干燥器环境下保存7 d，再次以微量肉汤稀释法测定抑菌活性，判断保存条件对药品的活性是否有影响。

1.4.1 药品溶液的配制 取表1 所述5 批实验室自制［14］新型磷霉素壳寡糖盐样品配制成1 mg/mL的药品溶液；配制1 mg/mL 标准磷霉素钙溶液，作为实验药品的对照组；制备麦氏比浊管，配制质量分数1%H2SO4溶液与质量分数1%BaCl2溶液，取0.1 mL H2SO4溶液与9.9 mL 质量分数1%BaCl2溶液，配制成1 麦氏浊度管，摇匀后取5 mL，加入5 mL 无菌水，制成0.5 麦氏比浊标准管，相当于1.5×108CFU/mL。

1.4.2 菌悬液制备 按照配方制备LB 液体培养基，称取5 g 蛋白胨，1.5 g 牛肉膏，2.5 g 氯化钠，置于烧杯中，加蒸馏水至500 mL，加热溶解后分装、灭菌，使用接种环分别从大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌斜面上挑取3 环，分别接入100 mL 液体培养基中，充分振摇，于37 ℃、160 r/min 条件下摇床培养约5 h 左右，使其达到对数生长期［15］，作为实验所用菌悬液。

1.4.3 最低抑菌浓度（MIC）值测定 将菌液稀释成相当于0.5 麦氏比浊标准的溶液，再用液体培养基以1∶100 倍数进行稀释，使含菌量数值达1.5*106CFU/mL；取无菌96孔板，于第一个孔加入100 μL 药品溶液，第二个孔加入100 μL 药品溶液和100 μL 液体培养基，依次倍比稀释，最后在每个孔加入80 μL 液体培养基及20 μL 菌悬液，使药品质量浓度梯度依次为，500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 μg/mL；在其后一孔加入共180 μL 液体培养基和20 μL 菌液，作为细菌生长组对照，最后一孔加入200 μL 液体培养基，作为培养基对照组，测量药品对5 种细菌的MIC 值，以文献记述方法［16］判定最低抑菌浓度：若细菌生长组呈浑浊状，培养基对照组呈清澈透明状，则表明药品溶液及培养基未受到污染，以梯度药物组中从低到高依次排列的第一个清澈透明孔中的药品浓度为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。本试验同时做3 组，取平均值作为最终MIC值。MIC 值越低，说明药品抑菌活性越强。

1.4.4 保存条件对药品抑菌活性的影响 将药品配制成1 mg/mL 的溶液进行上述MIC 测定；分别放置于-20 ℃冰箱及常温干燥器中，保存7 d 后再次测定其MIC 值；选取第一次实验结果中药品抑制效果较好的菌种作为试验菌，试验条件均相同，通过测量其最低抑菌浓度判断其抑菌效果是否受到影响。

2 结果与讨论

2.1 新型磷霉素壳寡糖盐对5 种病原菌的最低抑菌浓度（MIC）的测定结果

新型磷霉素壳寡糖盐5 批样品对5 种病原细菌的MIC 测定结果见表2，从表2 可知，5 批样品均具有抑菌活性，其中对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌两种细菌的抑菌效果都比较好，为3.9～15.6 μg/mL，效果明显比磷霉素钙的62.5 μg/mL 要低得多，说明本药品对这两种细菌的抑制效果较强；5 批样品对肺炎克雷伯菌的效果也较好，为15.6～52.1 μg/mL，但相比较磷霉素钙的62.5 μg/mL来说，抑菌效果的提升不高，仅FCOS-2、FCOS-3、FCOS-4 样品效果比较好，为15.6 μg/mL；5 批样品对沙门氏菌的抑菌效果和磷霉素钙持平，均为104.2～125 μg/mL，与磷霉素钙的抑菌效果无明显差别；5 批样品对大肠杆菌的抑菌效果不稳定，为15.6～104.2 μg/mL，FCOS-3 和FCOS-4 样品对大肠杆菌的抑菌效果比磷霉素钙好（15.6 μg/mL）FCOS-1、FCOS-2 和FCOS-5 的抑菌效果则比磷霉素钙的31.3 μg/mL 要低，说明本样品还有改进的空间。综合来看FCOS-3 和FCOS-4 两批药品的抑菌效果最好，在后续的制备中可以参照这两次的合成方法进行合成。

表2 磷霉素壳寡糖盐对5 种不同病原菌的最低抑菌质量浓度Tab.2 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against five different pathogens

2.2 新型磷霉素壳寡糖盐保存条件对病原细菌抑菌活性的影响

由上述实验可知5 批样品对Pae 和MRSA 的抑菌效果都比较好，且Pae 本身具有能够显色的特性，生长过程中可以使培养液变为绿色，利于观察；用同样效果较好的MRSA 对药品进行对照实验，利于对结果进行分析，由此选用Pae 和MRSA作为保存条件试验的试用菌，保存条件对磷霉素壳寡糖盐的抑菌活性影响结果见表3 和表4。由表可知，本药品在低温保存时稳定性较高，前后效果无明显差别，MIC 值为3.9～15.6 μg/mL，但将其置于干燥器中常温保存，效果出现显著降低，MIC值为125～250 μg/mL，说明该药品在常温、干燥条件下抑菌活性容易流失，这可能是由于这种条件下有效结构发生降解，从而影响药品的抑菌活性，因此在后续的药品贮存中应尽量在低温环境下进行保存，避免将药品放在常温干燥条件下。

表3 磷霉素壳寡糖盐对铜绿假单胞菌的最低抑菌质量浓度Tab.3 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against Pae μg/mL

表4 磷霉素壳寡糖盐对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度Tab.4 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against MRSA μg/mL

3 结 论

本文对实验室自制的5 批新型磷霉素壳寡糖盐样品进行了MIC 测定，测试了对Eco、MRSA、Pae、Kpn 和Sal 五种菌株的抗菌性能，并对保存条件对药品抑菌活性的影响进行研究，相比磷霉素钙而言，5 批磷霉素壳寡糖盐样品都对Kpn、MRSA和Pae 有较强的抑菌效果，尤其是针对MRSA 和Pae病原细菌，MIC 值均小于或等于15.6 μg/mL，显著低于对照药品磷霉素钙的MIC 值62.5 μg/mL，说明本药品对这两种菌有较强的抑制作用，尤其是FCOS-3、FCOS-4、FCOS-5 3 批样品对Pae 的抑菌效果为本次实验的最低浓度梯度，说明其具有更强的抑菌潜力，但本药品对Kpn 的抑菌效果较为不稳定，说明还有进行深入研究的必要；5 批药品对Sal 的抑菌效果和磷霉素钙基本持平，没有特别明显的差异，FCOS-1、FCOS-2、FCOS-5 3 批药品对大肠杆菌的抑制效果低于磷霉素钙，且FCOS-5的抑菌效果明显较弱，这可能是由于沙门氏菌及大肠杆菌有特别的耐药机制［17-18］，使细菌对本药品具有耐药性，因此针对这两种细菌需要更深入的研究。

本批次药品的保存条件对药品的抑菌活性有较大的影响，在-20 ℃冷藏保存条件下效果稳定，但置于常温干燥环境下抑菌效果会大幅下降，因此需要在低温环境进行贮存。5 批新型磷霉素壳寡糖盐对所选菌株均具有抑菌活性，且对于部分临床常见菌的效果如Pae 和MRSA 明显比现有药品磷霉素钙好，具有较好的开发前景。

与传统抗菌剂抗生素相比较，磷霉素壳寡糖盐具有较强的抑菌性能，但本药品的合成工艺目前较为不稳定，根据合成条件的不同，得到的产品性能差异较大，需要对每一批次药品做抗菌研究，因此对生产工艺需要进一步的研究。总体来看，磷霉素壳寡糖盐的水溶性和抗菌活性良好，在抗菌领域中具有较大的潜在应用价值，本文为开发具有高效、低毒的新型磷霉素壳寡糖盐药物提供了实验基础。