miRNA-1305 靶向硫氧还蛋白还原酶1 对三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡的影响△

2022-07-01 08:51王雨珂田程许新华
癌症进展 2022年9期
关键词:单克隆试剂盒抗体

王雨珂,田程,许新华

三峡大学第一临床医学院(宜昌市中心人民医院)肿瘤科,湖北 宜昌 443000

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是一种特殊类型的乳腺癌,雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2 表达皆为阴性。TNBC 是目前唯一一类无法行靶向治疗的乳腺癌亚型,预后差。TNBC 多发于40 岁以下未绝经年轻女性,占乳腺癌患者的15%~20%[1]。与其他亚型相比,TNBC 患者生存时间更短,确诊后前5年的病死率达40%。TNBC 侵袭性高,约46%的患者出现远处转移,转移后中位生存时间仅为13.3个月,术后复发率高达25%。非TNBC 患者平均复发时间为35~67个月,而TNBC患者则为19~40个月。TNBC 患者在复发后3 个月内病死率达到75%[2]。由于TNBC 对内分泌治疗和靶向治疗均不敏感,所以化疗是其主要系统治疗方法,但术后辅助放化疗效果并不好。贝伐珠单抗在一些国家与化疗药物联合治疗TNBC,患者的生存时间未显著延长[3]。因此,研究TNBC 的发生、发展及转移机制,有助于发现更多治疗TNBC的有效方法。miRNA是具有19~25个核苷酸的单链非编码RNA,可以改变基因的表达丰度,包括降低基因的表达,少数miRNA 可以诱导基因的表达。研究发现miRNA-1305 在肺癌、肝癌及TNBC 中表达下调[4-6]。但是miRNA-1305 在TNBC发生、发展中的作用及对硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1,TXNRD1)表达的影响未见报道。TXNRD1 是吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白及NADPH组成了硫氧还蛋白系统,在氧化还原平衡中发挥重要作用。研究发现TXNRD1 在TNBC 中表达显著上调[7]。本研究主要探究miRNA-1305 在TNBC 细胞MDAMB-231 中的表达水平及其上调后对TXNRD1 表达水平及细胞凋亡的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌细胞MDA-MB-231 购自协和细胞资源中心。DMEM/F12 培养基购自美国Hyclone 公司,马血清购自北京索莱宝科技有限公司,胎牛血清购自美国Gibco 公司,miRNA-1305 mimic 购自上海瑞基生物科技有限公司,B 细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)鼠单克隆抗体、Bcl-2 相关X 蛋白(Bcl-2-associated X protein,BAX)鼠单克隆抗体、cleaved caspase 3 鼠单克隆抗体、TXNRD1 兔单克隆抗体、GAPDH 鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗鼠抗兔抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司。胰蛋白酶、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液、5×loading buffer、SYBR Green Ⅰ及电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)超敏发光液均购自北京索莱宝科技有限公司,CCK8 试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司,Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific 公司,miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组 将MDA-MB-231 细胞随机分为3 组:Con 组(对照组)、miRNA NC 组(阴性对照组)和miRNA-1305 mimic 组。使用Lipofectamine 2000 将miRNA-1305 mimic 和NC 转 染至MDA-MB-231 细胞,Con 组细胞不进行转染。MDA-MB-231 细胞转染48 h 后进行处理。

1.2.2 CCK8 检测细胞活力 MDA-MB-231 细胞按上述方法转染处理后以104/孔密度接种到96 孔板。放至孵育箱培养24 h 后,加入CCK8 溶液,继续培养1 h 后,在450 nm 处测定光密度(optical density,OD)值。细胞活力=(OD实验-OD对照)/OD对照×100%。实验重复3 次,取均值。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 将MDA-MB-231 细胞接种至6 孔板,105/孔,然后按1.2.1 中的方法进行转染,收集各组细胞。细胞用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)漂洗,然后加入1×binding buffer 重悬细胞。加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液各5 μl 混匀,室温避光孵育10 min。细胞在1 h 内使用BD Accuri C6 流式细胞仪采集数据。

1.2.4 Western blot 检测凋亡相关蛋白 收集Con组、miRNA NC 组和miRNA-1305 mimic 组的MDAMB-231细胞,使用加入蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液冰上裂解细胞提取蛋白,使用BCA 法测定提取的蛋白浓度,提取蛋白液加入loading buffer 后95 ℃处理变性。取30 μg 蛋白样本进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate- polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)后,转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,使用5%脱脂牛奶(1×TBST)室温封闭1 h,加入Bcl-2、cleaved caspase 3、BAX、TXNRD1、β-actin 抗体4 ℃孵育过夜。用1×TBST洗涤3 次后再加入二抗室温孵育2 h,加入ECL 超敏发光液后用凝胶成像系统采集图像。

1.2.5 实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miRNA-1305 基因表达 使用miRcute miRNA 提取分离试剂盒提取miRNA-1305,然后使用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA第一链。用SYBR Green ⅠPCR 试剂在ABI Stepone Plus Real-time PCR 仪器中进行qRT-PCR 实验。以U6为内参,采用2-△△Ct法计算miRNA-1305在细胞中的相对表达量。引物序列:miRNA-1305正向,5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′,反向,5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′;U6正向,5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,反向,5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。

1.2.6 Kaplan-Meier 生存分析 采用KM Plot 数据 库(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)收集203 例TNBC 患者基因表达谱及预后生存信息,输入目的基因miRNA-1305,dataset 选择METABRIC(n=1262),依据cut-off=6.54 将其分为高表达组和低表达组,输出与目的基因相关的总生存期及统计学分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 3 统计分析软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-1305 相对表达量的比较及对TNBC患者总生存期的影响

TNBC 细 胞MDA-MB-231 转 染 后,miRNA-1305 mimic 组miRNA-1305 相对表达量明显高于Con 组和miRNA NC 组,差异均有统计学意义(P<0.01)(表1)。利用KM Plot 数据库对203 例TNBC患者进行预后分析发现,miRNA-1305 低表达的TNBC 患者总生存期短于miRNA-1305 高表达患者(HR=0.59,95%CI:0.37~0.96,P=0.032)(图1)。

表1 3组MDA-MB-231细胞中miRNA-1305相对表达量的比较(±s)

注:*与miRNA-1305 mimic组比较,P<0.01

图1 miRNA-1305低表达(n=51)与高表达(n=152)TNBC患者的生存曲线

2.2 MDA-MB-231 细胞活力的比较

miRNA-1305 mimic 组MDA-MB-231 细 胞 的OD 值明显低于miRNA NC 组和Con 组,差异均有统计学意义(P<0.01)。(表2)

表2 3 组MDA-MB-231 细胞OD 值的比较(±s)

注:*与miRNA-1305 mimic组比较,P<0.01

组别Con组miRNA NC组miRNA-1305 mimic组OD值100.00±4.36*100.00±4.00*53.00±7.56

2.3 MDA-MB-231 细胞凋亡的比较

miRNA-1305 mimic 组MDA-MB-231 细胞凋亡率 高 于Con 组 和miRNA NC 组,miRNA NC 组MDA-MB-231 细胞凋亡率与Con 组相比,无显著差异。(图2)

图2 流式细胞术检测3组MDA-MB-231细胞凋亡情况

2.4 Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1蛋白表达的比较

miRNA-1305 mimic 组细胞中Bcl-2、TXNRD1蛋白相对表达量明显低于Con 组和miRNA NC 组,BAX 和cleaved caspase 3 蛋白相对表达量明显高于Con组和miRNA NC组,差异均有统计学意义(P<0.01);miRNA NC 组与Con 组细胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1 蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(图3、表3)

表3 3 组MDA-MB-231 细胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1 蛋白表达的比较(±s)

表3 3 组MDA-MB-231 细胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3 和TXNRD1 蛋白表达的比较(±s)

注:*与miRNA-1305 mimic组比较,P<0.01

组别Con组miRNA NC组miRNA-1305 mimic组Bcl-2 0.81±0.19*0.79±0.23*0.35±0.17 BAX 0.41±0.17*0.38±0.16*0.78±0.22 cleaved caspase 3 0.51±0.16*0.59±0.19*1.01±0.20 TXNRD1 0.78±0.22*0.83±0.20*0.28±0.17

图3 Western blot法检测3组MDA-MB-231细胞中Bcl-2、BAX、cleaved caspase 3和TXNRD1蛋白表达情况

3 讨论

2015 年miRNA-1305 首次被报道能破坏吸烟者的牙周膜干细胞[8]。在非小细胞肺癌中miRNA-1305 下调后加快肿瘤的转移,患者的预后更差[8]。此外,miRNA-1305 通过竞争性结合泛素结合酶E2T 抑制蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)通路激活进而抑制肝癌细胞增殖[5]。这说明miRNA-1305 具有抑癌作用。本研究发现,miRNA-1305 可以抑制TNBC 细胞MDA-MB-231 活力,促进细胞凋亡,延长TNBC患者生存期。

硫氧还蛋白系统是一个重要的抗氧化系统,调控肿瘤细胞的细胞内氧化还原稳态和放疗敏感性。该系统包括硫氧还蛋白、TXNRD1、NADPH、内源性硫氧还蛋白抑制剂和硫氧还蛋白相关蛋白[9]。TXNRD1 是细胞主要的氧化还原调节因子,肿瘤细胞通常高表达硫氧还蛋白和TXNRD1 以应对活性氧的升高,抑制TXNRD1能够使活性氧升高从而增加乳腺癌细胞对放疗的敏感性[10]。硫氧还蛋白水平升高促进肿瘤细胞的生长及对化疗药物的抗性[11]。TNBC 患者TXNRD1 表达水平显著上调,抑制TXNRD1 促进了TNBC 细胞的凋亡[12]。沉默TXNRD1及TXNRD1 抑制剂auranofin 均能引起活性氧升高,增强赖氨酰氧化酶对MDA-MB-231 细胞的杀伤作用[13]。TXNRD1 是miRNA-1305 的靶蛋白之一[4]。本研究发现,上调miRNA-1305 表达抑制了TXNRD1 蛋白的表达。

细胞凋亡主要受死亡受体和线粒体通路调控,二者均可激活起始caspase 并激活效应caspase(caspase 3)。Bcl-2 家族蛋白通过线粒体通路介导细胞色素C 等物质的释放而导致细胞凋亡。本研究结果显示,miRNA-1305 通过下调Bcl-2,上调BAX、cleaved caspase 3 蛋白的表达,发挥促进MDA-MB-231 细胞凋亡的作用。

综上所述,miRNA-1305 通过调节TXNRD1的表达影响MDA-MB-231 细胞的凋亡,这为以miRNA-1305 为靶点治疗TNBC 提供了新的依据和方向。

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