寒区菌糠堆肥过程中微生物多样性与演替规律

赵铎，霍朝晨，徐智永，张方政，巩光禄，欧阳晓伦，刘嘉乐，郭鹏博，王伟东

（1.黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源化利用重点实验室/黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心；3.山东省潍坊市诸城市枳沟镇财政社保服务中心）

20 世纪以来，中国的食用菌产业不断扩大，据统计我国2018 年食用菌年产量超过4 000 万t，废弃菌糠的年产生量超过1 亿t[1-2]。据农业农村部农村社会事业发展中心数据显示，食用菌栽培业已成为农民增收和脱贫致富的重要途径。菌糠是食用菌栽培过程中产生的废弃栽培基质，主要由锯木屑、秸秆、玉米芯等农业废弃物组成[3]，在自然环境中的降解往往需要多种微生物共同作用。食用菌栽培后的菌糠中存在大量糖类、维生素、微量元素及其它次生代谢产物等[4]，因而具有循环利用价值。有研究报道，施用菌糠生产的肥料能够大幅度提高土壤理化参数、微生物丰度、土壤养分和酶活，进而增加农产品质量[5-7]。因此，实现废弃菌糠资源化再利用对农业废弃物消纳、发展循环经济、循环农业等具有重要意义。

目前，好氧堆肥能利用微生物的代谢作用将废弃菌糠转化为肥料，既能创造经济效益，又符合废弃物综合治理原则，是实现废弃菌糠循环利用的有效方式[8-9]。王秀红等[10]研究表明，堆肥各时期优势微生物菌群多样性差异显著。蔡涵冰等[11]发现，在堆肥升温期，芽孢杆菌属、梭菌属、假单胞菌属、曲霉属等参与纤维素降解和抑制植物病原菌生长密切相关的菌群占据优势[12-15]。Nakasaki 等[16]发现，随着堆肥过程进行，芽孢杆菌属、热子囊菌属等嗜热微生物在堆肥高温期丰度较高，堆肥微生物菌群的多样性显著提升。因此，探究堆肥过程中微生物多样性及其演替规律对于加速堆肥进程、提升堆肥品质具有重要意义。以往对于堆肥环境中微生物多样性研究多集中在农业废弃物、餐厨垃圾、养殖业粪便堆肥等方面[17-18]，而对寒区环境下菌糠堆肥环境中微生物多样性及演替规律研究较少。为了探究寒区菌糠堆肥过程中微生物多样性变化及其演替规律，研究采用高通量测序技术，检测、并分析菌糠堆肥过程中微生物多样性变化，为寒区废弃菌糠堆肥的规模化应用提供数据支撑，为实现寒区废弃菌糠的无害化和资源化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取黑木耳菌糠作为堆肥试验材料，黑木耳菌糠取自黑龙江省伊春市新青区食用菌栽培基地。

1.2 试验方法

废弃菌糠经脱袋、打碎、翻拌，调节含水率至60%。将菌糠堆砌成长1.9 m、下底宽1.5 m、上底宽1.2 m，高1.5 m 的长方体，体积为3.84 m3，菌糠堆肥试验共持续49 d。在试验当天、2、7～49 d（每7 d 一次）取样，取样前进行翻堆，充分混合物料。翻堆后采集堆肥样品约300 g（上中下三层取样，每层前后左右中五点），混合均匀后用于理化数据测定。根据堆体温度变化情况，分别于0 d（试验当天）、7、35、49 d取样，命名为S0、S7、S35、S49，用于菌糠堆肥微生物多样性分析。

1.3 样品指标及测定方法

堆肥过程中，每天8：30～9：00、13：30～14：00 测量堆体温度。称取风干样约5.0 g，按10∶1 水样比加入蒸馏水，震荡15 min，静置30 min，用pH 检测计（日本Horiba 公司）测定pH[19]。有机质、全氮、全磷、全钾含量采用国标法测定[19]。堆肥样品与去离子水1∶10混匀，180 r·min-1振荡浸提2.0 h，然后8 000 r·min-1离心20 min，浸提液用于种子发芽指数的测定[20]。

1.4 样品DNA 的提取与测序

样品DNA 提取采用氯苯法[21]，浓度和质量采用超微量分光光度计（Thermo Nanodrop 2000c，America）测定。改良后的细菌和古菌16S rRNA gene 引物为515F Modified（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′），806R Modified （5′ -GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）。真菌ITS1 区测序采用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。细菌和古菌扩增反应体系为（20 μL）：PCR supermix 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μM）1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL。细菌和古菌PCR 反应条件：95 ℃预变性2 min，98 ℃变性15 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃最终延伸5 min，28 个循环；真菌扩增反应体系为（20 μL）：PCR supermix 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μM）1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。真菌PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性60 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃最终延伸10 min，35 个循环。微生物多样性测序和分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.5 数据统计分析

以上所有试验均重复三次。数据处理与绘图采用OriginPro 2017C（SR2 b9.4.2.380），方差分析采用SPSS 17.0（2008-8-23）。

2 结果与分析

2.1 菌糠堆肥过程中理化性质变化

菌糠堆肥过程的温度变化如图1 所示，在堆肥升温阶段，微生物利用木耳菌糠中丰富的营养物质进行代谢活动，堆体内的有机物快速分解产生能量，短时间能量的堆积导致堆体温度快速升高，在菌糠堆肥第7 d 时，堆体温度68.3 ℃，为菌糠堆肥过程中堆体温度的峰值，高温期共持续27 d（大于50 ℃）。

图1 菌糠堆肥过程中温度的变化Fig.1 Changes of temperature during mushroom bran composting

如图2 所示，堆肥过程中，pH 的变化趋势为先降低，后升高最后趋于稳定，在堆肥中后期变化幅度较小。在堆肥过程中，物料初始pH 为8.49，在堆肥前7 d 快速下降，最低值为8.29。随着堆肥的进行，pH稳步上升，在堆肥末期pH 为8.49。

在试验中，有机质含量呈现逐渐降低的趋势，在整个堆肥过程中，有机质降解率为16.6%。如图3 所示，堆肥原料的有机质含量为81.9%，堆肥49 d 后下降至65.3%，其中在堆肥前7 d，有机质降解率为9.8%。而在堆肥末期，有机质降解速率较低，几乎不再分解。

图3 菌糠堆肥过程中有机质含量的变化Fig.3 Changes of organic matter content during mushroom bran composting

菌糠堆肥过程中，全氮含量随着堆肥试验的进行持续提高，与全磷、全钾相比，出现明显上升。但总体上看，其绝对含量仍然较低。全磷、全钾和全氮由堆肥初始物料中的0.54%、0.3%和1.07%，分别上升至0.65%、0.34%和1.37%。经过49 d 的好氧堆肥后，养分含量整体上有所提升。

种子发芽指数（GI）可以用来评价堆肥物料的腐熟程度，用物料对植物种子发芽情况的影响来表达物料的毒性作用[22]。当GI＞50%，物料已经基本腐熟，堆肥样品对植物的毒性作用较低。当GI＞80%，即可认为物料完全腐熟，此时堆肥样品对植物的毒性几乎为零[23]。如图5 所示，GI 在降温期之前增长较快，在堆肥末期，GI 为85.5%。

图5 菌糠堆肥过程中种子发芽指数的变化Fig.5 Changes of germination index during mushroom bran composting

图4 菌糠堆肥过程中不同时期全磷、全钾和全氮含量的变化Fig.4 Changes of total nitrogen，total phosphorus，total potassium content during mushroom bran composting

2.2 堆体微生物群落α 多样性分析

表1 是菌糠堆肥过程不同时期的Alpha 指数，在整个堆肥过程中，Chao1 和ACE 指数整体上呈逐渐降低的趋势，Chao1 指数从1 832.66 下降至1 697.00，ACE 从1 832.66 下降至1 697.60。Simpson 和Shannon 指数整体上呈现先下降后上升的趋势，在S0 样品中各指数值均显著高于其他时期（P<0.05）。表2 是菌糠堆肥过程中真菌的Alpha 多样性指数，Chao1 和ACE 指数的趋势为先下降后升高。Simpson 指数由0.82 上升至0.89，Shannon 指数由3.69 升高至4.42。其中，S0 样品中的Chao1 和ACE 指数最高，S49 样品的Simpson 和Shannon 指数最高。

表1 菌糠堆肥过程中细菌的Alpha 多样性指数Table 1 Alpha diversity index of bacteria in mushroom bran composting

表2 菌糠堆肥过程不同时期的真菌Alpha 多样性指数Table 2 Alpha diversity index of fungi in different periods of mushroom bran composting

2.3 堆体微生物群落组成及差异分析

如图7、8，表3、4 所示，是基于16S rRNA 基因高通量测序结果分析得出的门、属水平上微生物的相对丰度变化。

变形菌门在S0 和S7 样品中相对丰度较高，在S35 样品中显著下降至40.89%（P<0.05）。在菌糠堆肥过程中，拟杆菌门全程未发生显著变化（P＞0.05）。放线菌门在S0 样品中的相对丰度为4.84%，在S7 样品中显著提高，为26.98%（P<0.05）。在S7 样品中，疣微菌门的相对丰度由S0 样品中的的2.41%显著下降至0.14%（P<0.05），随后其相对丰度显著提升（P<0.05），最终保持在2%左右。厚壁菌门的相对丰度没有发生显著变化（P＞0.05）。

图6 菌糠堆肥过程中细菌群落门水平相对丰度Fig.6 The relative abundance of bacteria community at phylum level during mushroom bran composting

如表3，优势细菌属的组成和相对丰度在不同堆肥时期显著差异（P<0.05）。在S0 样品中主要的优势微生物为鞘脂杆菌属（11.22%）、黄杆菌属（6.37%）等8 个菌属。在S7 样品中，鞘脂杆菌属的相对丰度显著提升至21.57%（P<0.05），Buttiauxella 显著提升至5.81%（P<0.05）。但S7 样品中菌属相对丰度之和显著高于S0 样品（P<0.05），假黄单胞菌属（14.59%）、不动杆菌属（5.14%）的相对丰度显著提升。在S35 样品中，除Parapedobacter 和噬热多孢菌属的相对丰度显著提升至13.46%和10.64%外（P<0.05），S7 样品中其他优势菌属的相对丰度均有所下降。S49 样品的群落结构与S35 的相似，仅鞘脂杆菌属的相对丰度提升了5.3%。

表3 菌糠堆肥过程中细菌群落属水平相对丰度Table 3 The relative abundance of bacteria community at genus level during mushroom bran composting

如图7，在真菌门水平上，子囊菌门、担子菌门和接合菌门是主要的优势微生物类群，堆肥各时期中无显著变化。如表4，木耳属、鬼伞属、木霉属等12 个真菌属为优势菌属，堆肥不同时期的样品在菌属组成和相对丰度生均有显著差异（P＜0.05）。在S0 样品中，相对丰度较高的菌属分别为木霉属（30.04%）、木耳属（25.39%）。在S7 样品中，木霉属、木耳属、Coniochaeta 和粘束孢属的相对丰度显著降低至13.97%、20.75%、0.71%和4.59%（P＜0.05）。S7 样品中Thermomyces、Mycothermus 分 别 提 高 了10.01% 、8.72%（P ＜0.05）。在S35 样 品 中，鬼 伞 属、Pseu dallescheria 的相对丰度分别提升了21.57%、14.23%（P＜0.05）。在S49 样品中，主要优势微生物的总相对丰 度 显 著 下 降（P ＜0.05），与S7 样 品 相 比，Ther momyces 和Peziza 的相对丰度显著提升（P＜0.05）。

图7 菌糠堆肥过程中真菌群落门水平相对丰度Fig.7 The relative abundance of fungus community at phylum level during mushroom bran composting

表4 菌糠堆肥过程中真菌群落属水平相对丰度Table 4 The relative abundance of fungus community at genus level during mushroom bran composting

3 讨论

堆体温度是堆肥各时期微生物活性的宏观指标[24]，受原料组成、有机质含量、pH 等理化参数的影响较大[25]。在菌糠堆肥过程中，堆体最高温度达到68.3 ℃，高温期持续21 d，可能是菌糠质地疏松保水性好，并且富含蛋白质、维生素等多种养分，堆肥过程中微生物的代谢活动增强，释放大量的能量导致堆体温度快速升高。在堆肥初期，物料中木质纤维素类物质被木质纤维素降解菌分解利用，产生大量的小分子酸，使堆肥体系的pH 不断降低，随着堆肥物料的发酵，小分子酸被微生物利用，堆肥体系的pH上升。李章海等人研究发现pH 在7.5～8.5 时可以加快腐熟速率[26]，与研究中菌糠堆肥的pH 变化趋势类似。堆肥初期微生物代谢旺盛且活性较高，有机物被快速转化，因此，在试验中，有机质分解率在堆肥升温期快速上升。

试验在S0 样品中检测到木霉属和木耳属的相对丰度较高，研究表明二者在木耳栽培过程中发挥重要作用[27-28]，在堆肥过程中接种木霉可以有效延长牛粪堆肥的高温期并且减少氮素损失[29-30]，这可能是试验堆肥物料中总氮含量升高的原因。与S0 相比，S7 样品中菌群丰富度和多样性均下降，可能是因为在升温阶段物料中的易降解有机物被消，并且耗随着物料的发酵，堆体温度快速上升，抑制了部分嗜温微生物的生长。鞘脂杆菌属能降解多环芳香烃类物质，可降解肥料中有机物，从而减少污染物危害，促进植物的生长[31-32]，这可能是其在S35 样品中显著提高的原因。与S7 样品相比，S35 样品中微生物的相对丰度均有所下降，可能是因为易利用有机物在高温期被大量消耗，降温期的易降解有机物含量较低，微生物生长所需的营养物质匮乏，导致微生物的代谢活动减弱。假黄单胞菌属已被证明与木质纤维素降解相关[33]，在试验中假黄单胞菌属的相对丰度显著提升。不动杆菌属、噬热多孢菌属在试验S7 样品比S0样品显著提高（P＜0.05），有研究表明不动杆菌属能够高效降解木质素[34-35]，贾洋洋等[36]发现噬热多孢菌属在好氧堆肥降解木质纤维素的过程中发挥重要作用，说明堆肥发酵对菌糠中的木质纤维素类物质具有较好的降解效果。与S7 样品相比，在S35 样品中木质纤维素降解菌群的代谢活性增强，可能是S35样品中菌群多样性提高的原因。在菌糠堆肥发酵过程中，真菌分泌胞外酶，加快难降解有机物的分解效率[37-38]，对菌糠堆肥具有促进作用。

4 结论

（1）在低温环境下，菌糠堆肥不同时期的细菌多样性差异显著，真菌在高温期和腐熟期的多样性差异显著，古菌多样性极低。

（2）菌糠堆肥物料可以完全腐熟，总养分含量相对较低。