卡维地洛对ox-LDL诱导内皮细胞中NLRP3炎症小体介导焦亡及炎症的影响

闫凯欣， 徐 霄， 补 娟， 徐 红

(新疆维吾尔自治区人民医院 1.老年医学中心，2.骨科关节与运动医学病区，3.临床医学研究中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830000；4.新疆医科大学研究生学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000)

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)对血管内皮细胞的损害贯穿动脉粥样硬化全过程，卡维地洛是临床上广泛应用的第三代β受体阻滞剂，新近有研究证实其在ox-LDL诱导内皮细胞损伤过程中发挥保护作用[1]，但相关的分子机制尚不清楚。NLRP3炎症小体在高糖高脂环境下发挥重要的生物学效应，一方面促进GSDMD剪切为GSDMD-N并介导细胞焦亡，另一方面促进白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18释放并介导炎症反应[2]。已有研究报道ox-LDL诱导内皮细胞损伤时高表达NLRP3炎症小体介导细胞焦亡及炎症反应，抑制NLRP3显著减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤[3-4]。基于此，本研究将NLRP3炎症小体为靶点，探讨卡维地洛对ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)中NLRP3炎症小体介导焦亡及炎症的调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC(上海子实生物科技有限公司)。卡维地洛(上海佰世凯化学科技公司)，ox-LDL(MEC公司)，阴性对照(NC)及过表达NLRP3的腺病毒(金唯智生物科技公司)，MTS检测试剂盒(Abcam公司)，IL-1β、IL-18 ELISA检测试剂盒(江苏科特生物科技公司)，GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1及β-actin的特异性一抗及辣根过氧化物酶二抗(CST公司)。

1.2 HUVEC培养及分组

HUVEC培养于含10%胎牛血清的完全培养基中，常规消化传代后进行分组干预。对照组不干预，ox-LDL组用100 mg/L ox-LDL处理，低剂量组、高剂量组分别用含0.01或0.1 mmol/L卡维地洛+100 mg/L ox-LDL处理。在上述干预基础上，Ad-NC组、Ad-NC+ox-LDL组和Ad-NC+高剂量组转染NC腺病毒，Ad-NLRP3+高剂量组转染过表达NLRP3腺病毒。腺病毒转染的系数均设置为75。每组均连续干预24 h。

1.3 MTS法检测细胞活力

细胞接种于96孔板，分组干预后12、24 h分别加入MTS试剂盒检测液，20 μL/孔，继续培养4 h后将培养板放入酶标仪，波长490 nm，检测各组光密度OD490。

1.4 ELISA检测IL-1β、IL-18含量

细胞接种于12孔板，分组干预后24 h收集培养基，采用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-18含量，收集细胞并采用BCA法检测细胞裂解液中蛋白含量，计算IL-1β、IL-18含量与细胞蛋白含量比值。

1.5 Western blotting检测GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1表达

细胞接种于12孔板，分组干预后24 h弃去培养基、收集细胞，裂解细胞后得到裂解液，将含有30 μg蛋白裂解液与缓冲液混合后行Western blotting检测，分别进行电泳、电转膜、孵育特异性一抗过夜及孵育辣根过氧化物酶二抗，最后在凝胶成像系统中通过ECL法显影得到目标蛋白GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1，以β-actin为内参计算GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1表达水平。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 过表达NLRP3对卡维地洛抑制细胞活力的影响

干预12、24 h，HUVEC细胞活力ox-LDL组低于对照组，不同剂量卡维地洛组高于ox-LDL组，且高剂量组高于低剂量组(P<0.05)。转染腺病毒后，HUVEC细胞活力Ad-NC+ox-LDL组低于Ad-NC组，Ad-NC+ox-LDL组和Ad-NLRP3+高剂量组低于Ad-NC+高剂量组(P<0.05；表1)。

表1 各组HUVEC细胞活力的比较(n=4)

2.2 过表达NLRP3对卡维地洛抑制细胞焦亡及炎症反应的影响

干预24 h，IL-1β、IL-18及GSDMD-N水平ox-LDL组高于对照组，不同剂量卡维地洛组低于ox-LDL组，且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。转染腺病毒后，IL-1β、IL-18及GSDMD-N水平Ad-NC+ox-LDL组高于Ad-NC组，Ad-NC+ox-LDL组和Ad-NLRP3+高剂量组高于Ad-NC+高剂量组(P<0.05；表2和图1)。

表2 各组HUVEC中IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表达水平的比较(n=4)

图1 各组HUVEC中GSDMD-N表达的比较(Western blotting)

2.3 过表达NLRP3对卡维地洛抑制NLRP3炎症小体表达的影响

干预24 h，NLRP3、Cleaved Caspase-1表达水平ox-LDL组高于对照组,不同剂量卡维地洛组低于ox-LDL组,且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。转染腺病毒后，NLRP3、Cleaved Caspase-1表达水平Ad-NC+ox-LDL组高于Ad-NC组，Ad-NC+ox-LDL组和Ad-NLRP3+高剂量组低于Ad-NC+高剂量组(P<0.05；表3和图2)。

表3 各组HUVEC中NLRP3、Cleaved Caspase-1表达水平的比较(n=4)

图2 各组HUVEC中NLRP3、Cleaved Caspase-1表达的比较(Western blotting)

3 讨 论

卡维地洛是β受体阻滞剂，有研究报道卡维地洛对As大鼠的动脉病理改变具有改善作用，提示卡维地洛具有抗As的作用[5]。文波等[1]细胞实验证实，卡维地洛在ox-LDL诱导主动脉内皮细胞损伤过程中起保护作用，这与其在动物模型中改善As的作用吻合。本研究参考文献[6]以100 mg/L ox-LDL刺激HUVEC建立内皮细胞损伤模型，不同剂量卡维地洛干预后细胞活力明显增加，表明卡维地洛对ox-LDL诱导的HUVEC损伤具有保护作用。

Ox-LDL诱导内皮损伤的过程涉及炎症反应、凋亡及焦亡、氧化应激等，其中炎症反应和焦亡在调控机制上存在共同的上游分子即NLRP3炎症小体[7]。在高糖、高脂、高同型半胱氨酸、吸烟等病理因素的刺激下，NLRP3表达增加并招募Caspase-1使其裂解为有活性的Cleaved Caspase-1，后者一方面使GSDMD氨基末端发生裂解生成GSDMD-N并介导细胞焦亡，另一方面使无活性的IL-1β、IL-18前体裂解为有促炎活性的IL-1β、IL-18成熟体并介导炎症反应[8-11]。本研究发现，ox-LDL处理HUVEC后，培养基中IL-1β、IL-18含量及细胞中NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N表达水平均增加，提示ox-LDL诱导HUVEC损伤过程中存在细胞焦亡及炎症反应的过度激活。本研究给予不同剂量卡维地洛干预后，ox-LDL诱导的细胞焦亡及炎症反应均显著受到抑制，提示卡维地洛在ox-LDL诱导HUVEC损伤过程中起到抗焦亡及抗炎作用，这可能是该药物发挥内皮保护作用相关的分子机制。

NLRP3炎症小体对细胞焦亡和炎症反应的调控作用已经被多项研究证实，使用NLRP3抑制剂或敲低NLRP3均能减轻ox-LDL或高糖诱导的内皮细胞损伤，同时抑制细胞焦亡和炎症反应[12-14]。本研究发现，卡维地洛在ox-LDL诱导HUVEC损伤过程中抑制NLRP3炎症小体的表达及下游细胞焦亡、炎症反应，为了进一步明确NLRP3炎症小体在卡维地洛减轻内皮损伤中的作用，本研究设计了过表达NLRP3的腺病毒，在卡维地洛干预的同时转染腺病毒以增加NLRP3的表达，在过表达NLRP3后，卡维地洛增加细胞活力、减轻细胞焦亡及炎症反应的作用被削弱，提示卡维地洛在ox-LDL诱导HUVEC损伤过程的保护作用部分与其抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡和炎症反应有关。

综上所述，卡维地洛在ox-LDL诱导HUVEC损伤过程中发挥保护作用，抑制ox-LDL诱导NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡及炎症反应是卡维地洛发挥上述变化作用的相关分子机制之一，为As发病过程中内皮损伤防治手段提供了新思路，也为深入认识NLRP3炎症小体介导内皮细胞焦亡及炎症反应在As发病中的作用提供了新靶点。