丹红注射液治疗大鼠肺动脉高压的作用及机制研究

余松平　詹宇亮　涂伟玲　孙汉俊　李彬

【摘要】 目的：探討丹红注射液治疗肺动脉高压（pulmonary hypertension， PH）的分子生物学机制。方法：选择雄性SD大鼠36只，采用随机数字表法分为Normal组、MCT组、MCT+BT组、MCT+BT+DHI组，每组9只。采用腹腔注射野百合碱法复制PH大鼠模型，采用右心导管法测定大鼠平均肺动脉压，采用免疫组织化学方法测定肺组织中血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达，HE染色观测肺动脉平滑肌细胞组织病理学变化，运用蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测肺组织中细胞内磷酸化丝/苏氨酸激酶（Akt）、内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）蛋白的表达。结果：与Normal组比较，MCT组大鼠的mPAP明显上升（P<0.05）;与MCT组比较，MCT+BT组、MCT+BT+DHI组大鼠的mPAP均明显下降（P<0.05）;MCT+BT组与MCT+BT+DHI组大鼠的mPAP比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与Normal组的WT比较，MCT组的WT明显上升（P<0.05）;与MCT组比较，MCT+BT组、MCT+BT+DHI组的WT均明显下降（P<0.05）;与MCT+BT组比较，MCT+BT+DHI组的WT明显下降（P<0.05）。与Normal组的VEGFA平均光密度值比较，MCT组的VEGFA 平均光密度值明显上升（P<0.05）;与MCT组比较，MCT+BT组、MCT+BT+DHI组的VEGFA平均光密度值均明显上升（P<0.05）;与MCT+BT组比较，MCT+BT+DHI组VEGFA蛋白平均光密度值明显上升（P<0.05）。与Normal组比较，MCT组Akt、eNOS蛋白的相对表达量均明显下降（P<0.05）;与MCT组比较，MCT+BT组、MCT+BT+DHI组的Akt、eNOS蛋白的相对表达量均明显上升（P<0.05）;与MCT+BT组比较，MCT+BT+DHI组的Akt、eNOS蛋白的相对表达量均明显上升（P<0.05）。结论：丹红注射液不仅能够改善PH模型大鼠肺动脉平滑肌细胞病理形态学变化，促进血清VEGFA的生成和释放，并且能够调节Akt、eNOS蛋白的表达，从而抑制肺血管重塑，调节肺动脉舒张功能。

【关键词】 肺动脉高压 丹红注射液 VEGFA PI3K/Akt/eNOS信号通路

Effect and Mechanism of Danhong Injection on Pulmonary Hypertension in Rats/YU Songping， ZHAN Yuliang， TU Weiling， SUN Hanjun， LI Bin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： 0-015

[Abstract] Objective： To explore the molecular biological mechanism of Danhong Injection in the treatment of pulmonary hypertension （PH）. Method： A total of 36 male SD rats were randomly divided into Normal group， MCT group， MCT + BT group and MCT + BT + DHI group， with 9 rats in each group. The PH rat model was established by intraperitoneal injection of monocrotaline. The mean pulmonary artery pressure was measured by right cardiac catheterization. The expression of VEGFA in lung tissue was measured by immunohistochemical method. The histopathological changes of pulmonary artery smooth muscle cells were observed by HE staining. The expression of Akt and eNOS protein in lung tissue was detected by Western blot. Result： Compared with Normal group， mPAP in MCT group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， mPAP in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group decreased significantly （P<0.05）; there was no significant difference in mPAP between MCT + BT group and MCT + BT + DHI group （P>0.05）. Compared with WT in Normal group， WT in MCT group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， WT in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group decreased significantly （P<0.05）; compared with MCT + BT group， WT in MCT + BT + DHI group decreased significantly （P<0.05）. Compared with the average optical density of VEGFA of Normal group， the average optical density of VEGFA of MCT group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， the average optical density of VEGFA in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT + BT group， the average optical density of VEGFA protein in MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）. Compared with Normal group， the relative expression of Akt and eNOS protein in MCT group decreased significantly （P<0.05）; compared with MCT group， the relative expression of Akt and eNOS protein in MCT + BT group and MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）; compared with MCT + BT group， the relative expression of Akt and eNOS protein in MCT + BT + DHI group increased significantly （P<0.05）. Conclusion： Danhong Injection can not only improve the pathological changes of pulmonary artery smooth muscle cells in PH model rats， promote the production and release of serum VEGFA， but also regulate the expressions of Akt and eNOS proteins， thereby inhibiting pulmonary vascular remodeling and regulating pulmonary artery diastolic function.

[Key words] Pulmonary hypertension Danhong Injection VEGFA PI3K/Akt/eNOS signaling pathway

First-author’s address： Jiangxi Provincial People’s Hospital， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.003

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是以肺血管阻力进行性增高为主要特征的一种临床综合征，主要由于通过肺循环的血流受阻，导致肺动脉压力病理性升高，可造成右心衰竭[1]。PH患者的诊断标准为，以海平面大气压为参照，在静息状态下，经右心插入导管测得平均肺动脉压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25 mmHg[2]。根据流行病学调查显示，超过85%的PH患者由左心疾病、肺部疾病和/或缺氧引起[3]。目前应用于临床的抗PH药物有波生坦（Bosentan，BT）、依前列醇（Epoprostenol，EP）等，虽然能够调节肺动脉收缩功能，但对于靶向肺动脉重构过程仍有待进一步研究[4]。研究发现，丹红注射液（Danhong Injection，DHI）可以通过多途径作用于血管内皮，促进血管的生成和修复[5]。为进一步探究DHI对肺动脉血管内皮的靶向作用，本研究拟观察DHI对PH大鼠模型肺动脉平滑肌细胞病理形态学及血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），细胞内磷酸化丝/苏氨酸激酶（Akt），内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表达的影响，探究DHI治疗PH的可能作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。雄性清洁级SD大鼠36只，平均（2.03±0.26）月龄，体重（220±20）g，由南昌大学医学部实验动物中心提供[许可证号：SYXK（赣）2015-0001]。按照国家科委颁布的《实验动物管理条例》进行适应性饲养1周。（2）药物和试剂。波生坦片（生产厂家：加拿大Patheon Inc，批准文号：注册证号H20170013，规格：

125 mg/片）;丹红注射液（生产厂家：山东丹红制药有限公司，批准文号：国药准字Z20026866，规格：10 mL/支）;98%野百合碱（美国 Sigma），苏木素-伊红（HE）染液（美国Solarbio）;大鼠VEGFA单克隆抗体（英国Abcam）;抗Akt、eNOS抗体（美国Cell signaling）。（3）仪器。YP-200型压力换能器（北京新航兴业科贸有限公司）;MedlabU/4C生物信号釆集处理器（南京美易科技有限公司）;BX51光学显微镜（日本 Olympus 电子公司）;LEICACM-1950冰冻切片机（德国徕卡公司）;H3-18K台式高速离心机离心力（德国Sigma 公司）;Western-blot仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 选择雄性SD大鼠36只，采用随机数字表法分为Normal组、MCT组、MCT+BT组、MCT+BT+DHI组，每组9只。MCT给药剂量（MCT组、MCT+BT组、MCT+BT+DHI组）按1 mL/200 g

比例一次性腹腔注射2%中链甘油三酯（MCT），Normal组按1 mL/200 g比例一次性腹腔注射0.9%氯化钠注射液。常规饲养4周后，禁食、水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，备皮充分暴露右側颈部皮肤，常规消毒后进行右侧颈静脉穿刺，穿刺成功后将注入适量肝素的导管沿颈外静脉插入右心房，连接YP-200型压力换能器，接入MedlabU/4C生物信号釆集处理器，观察计算机反馈的图像和波形，确认导管经右心室进入肺动脉，待波形稳定后，记录大鼠mPAP数值，以波形稳定状态下mPAP≥25 mmHg为造模成功。

1.2.2 分组及给药 MCT+BT组同时注射MCT 1 mL/200 g与BT 50 mg/（kg·d）、MCT+BT+DHI组同时注射MCT 1 mL/200 g、BT 50 mg/（kg·d）、DHI 50 mg/（kg·d），其他组（Normal组和MCT组）按同等剂量予以0.9%氯化钠注射液腹腔注射，连续干预2周。

1.2.3 标本采集及测定 （1）干预结束后，禁食、水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，右侧颈静脉穿刺后经右心房向肺动脉送入导管，测得大鼠mPAP数值。放血法处死大鼠，迅速取出肺组织并分离肺动脉，用生理盐水冲净后再经梯度酒精脱水，留取部分肺组织-80 ℃冰箱冻存，另外一部分肺组织和肺动脉用4%多聚甲醛固定后，依次进行透明、浸蜡、包埋和制片。选择较粗的肺动脉主干部位的切片进行HE染色，光学显微镜下观察大鼠肺动脉平滑肌细胞组织病理学变化，并将肺动脉管壁厚度与血管外径的横截面拍摄并转换为数字图像，计算管壁厚度与血管外径比值WT。（2）选取合适的肺组织切片，依次进行脱蜡、修复、冷却、冲洗和稀释后，先加入5%正常山羊血清，室温封闭条件下孵育30 min，然后进行一抗孵育，去掉血清，滴加1︰1 000 VEGFA单克隆抗体，室温4 ℃过夜再进行二抗孵育，1 h后在光学显微镜下采集图像，光镜下血管周围显现棕黄色的颗粒物，则为阳性反应。将采集的图像导入Image-Pro Plus软件中检测平均光密度值（IOD/Area），以IOD/Area的大小表示VEGFA表达的水平。（3）称取200 mg冰冻的肺组织，加入1 mL裂解液在4 ℃下充分匀浆，30 min后转移充分裂解后的匀浆液至离心管中，在室温4 ℃，以12 000 r/min离心10 min后得到上层清液，并测定蛋白含量。再以每孔20 μL进行上样，经电泳2 h后转至PVDF膜上进行常规抗体孵育，待二抗孵育完成1 h后，于暗室中加入曝光液，充分曝光30 min后获得底片显影图像，利用Adobe Photoshop CC软件对扫描底片显影图像所得的条带进行灰度值分析，以β-actin蛋白条带积分光密度值为参照，目标蛋白的相对表达量P=目标蛋白条带积分光密度值/β-actin蛋白条带积分光密度值。

1.3 统计学处理 利用SPSS 24.0对所有数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mPAP比较 与Normal组的mPAP（9.21±6.79）mmHg比较，MCT组的（31.28±10.37）mmHg明显上升（P<0.05）;与MCT组的mPAP比较，MCT+BT组的（23.43±8.58）mmHg、MCT+BT+DHI组的（20.69±9.38）mmHg均明显下降（P<0.05）;MCT+BT组与MCT+BT+DHI组大鼠的mPAP比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2 大鼠肺动脉平滑肌细胞病理变化 大鼠肺动脉血管典型病理变化见图2。与Normal组的WT（17.43±4.93）%比较，MCT组的（38.24±7.52）%明显上升（P<0.05）;与MCT组的WT比较，MCT+BT组的（25.33±5.14）%、MCT+BT+DHI组的（18.73±4.32）%均明显下降（P<0.05）;与MCT+BT组比较，MCT+BT+DHI组的WT明显下降（P<0.05）。见图3。

2.3 对大鼠肺组织VEGFA蛋白平均光密度值的影响 免疫组化法检测结果显示，与Normal组的VEGFA蛋白平均光密度值（0.86±0.06）比较，MCT组的（1.33±0.01）明显上升（P<0.05）;与MCT组的VEGFA蛋白平均光密度值比较，MCT+BT组的（1.42±0.05）、MCT+BT+DHI组的（1.77±0.02）均明显上升（P<0.05）;与MCT+BT组比较，MCT+BT+DHI组VEGFA蛋白平均光密度值明显上升（P<0.05）。见图4。

2.4 对大鼠Akt、eNOS蛋白表达的影响 P-Akt、P-eNOS蛋白的相对表达量分别为（0.96±0.04）、（0.98±0.05），与Normal组比较，MCT组（0.63±0.03）、（0.62±0.06）均明显下降（P<0.05）;与MCT组的P-Akt、P-eNOS蛋白的相对表达量比较，MCT+BT组（0.75±0.05）、（0.72±0.05），MCT+BT+DHI组（0.97±0.06）、（0.99±0.06）均明显上升（P<0.05）;与MCT+BT组比较，MCT+BT+DHI组的Akt、eNOS蛋白的相对表达量均明显上升（P<0.05）。见图5、6。

3 讨论

根据最新流行病学调查显示，占全球1%的人口深受PH的困扰，尤其是在65岁以上人群中患病率高达5%～10%[6]，且PH预后极差，被称为“心血管系统的恶性肿瘤”。关于引起PH的病因较为复杂，约有40种疾病的发生发展与PH相关，并且根据其临床特征大致可分为五类，分别为与动脉相关的PH、由左心疾病导致的PH、由肺部疾病和/或低氧导致的PH、由慢性血栓栓塞导致的PH以及不明因素或多因素综合作用导致的PH[1，7]。目前关于PH的发生发展，大多数研究认为与肺动脉血管重构有关，而引起肺动脉血管重构的主要病理改变为肺动脉平滑肌细胞异常增殖和肥大。研究表明，肺动脉平滑肌细胞的增殖机制受多种生长因子受体水平改变及相关信号通路调节的影响[8-11]。

VEGFA是公认的促进血管生成的重要因子，参与并调节了胚胎的发育及血管的生成过程[12]。体外研究发现，VEGF的增加可減少人肺微血管内皮细胞产生内皮素-1（endothelin-1，ET-1）表达，从而抑制肺血管重塑[13]。PI3K是一种磷脂酰肌醇酶，Akt是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，eNOS是一种一氧化氮合酶，近年来研究发现，PI3K可通过激活下游的Akt调控eNOS的活性，而血管内皮细胞内的被激活的eNOS作用于L-精氨酸，在分子氧的参与下可合成具有调节肺血管的内皮源性血管舒张因子一氧化氮（nitric oxide，NO）[14]。

目前应用于临床的抗PH药物波生坦通过拮抗内皮素受体A/B（endothelial receptor A/B，ETR-A/B），阻止ET-1与肺动脉平滑肌细胞ETR-A/B结合，使ET-1无法产生强烈的收缩血管作用，进而改善患者血流动力学参数[15]。尽管波生坦在抗PH的作用上疗效确切，但有研究表明，联合波生坦的多靶向治疗较单药治疗更能改善患者预后[16]。现代药理学研究表明，DHI可以调节多个疾病相关的途径，实现促血管新生、改善血管内皮功能、改善血管血流、保护血管内皮等过程[17]。DHI含有五种活性成分，分别为丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和羟基红花黄色素A，研究发现，这五种活性成分均可促进内皮细胞增殖，促进VEGAF的表达，并且丹参素和羟基红花黄色素A促进新生血管活性较显著[18]。还有研究发现，DHI可通过激活心肌细胞PI3K/Akt信号通路，抑制心肌缺血-再灌注过程中心肌细胞的凋亡[19]。但目前关于DHI激活肺组织PI3K/Akt信号通路发挥肺动脉血管内皮细胞保护效应的报道较少。

本研究通过复制大鼠PH模型，应用BT和DHI干预2周后，大鼠肺动脉平滑肌细胞病理变化改善明显;检测VEGFA的含量及PI3K、Akt、eNOS蛋白的表达，结果显示BT+DHI能够促进血清VEGFA的生成和释放，抑制肺血管重塑，调节肺动脉舒张功能，抑制肺血管内皮细胞凋亡，进而改善肺动脉平滑肌细胞病理变化。另外，本次实验仅观测了BT+DHI调节肺动脉血管内皮个别因子，虽然反映了BT与DHI联合的多靶向调节作用，但有关BT与DHI联合应用是否会增加单独应用BT不良反应的发生率仍有待进一步研究。

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（收稿日期：2021-10-18） （本文编辑：占汇娟）