粪菌移植对酒精性肝损伤大鼠肠黏膜屏障功能及肝功能的影响

徐国峰

【摘要】 目的：研究粪菌移植（FMT）对酒精性肝损伤（ALI）大鼠肠黏膜屏障功能及肝功能的影响。方法：2021年4-6月将30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（C组）、酒精模型组（M组）和FMT治疗组（T组），每组10只。C组给予等容量蒸馏水灌胃，基础饲料饲养;M组、T组按10 mL/kg，给予56°白酒灌胃，持续8周，第5周开始，T组给予粪菌液灌胃，C组及M组均给予生理盐水。测定并比较各组大鼠的生理学指标（体重、肝指数）、血液相关指标[D-乳酸（D-LA）、血浆内毒素水平（ET）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）]，对肝组织进行HE染色，观察光镜下肝组织病理变化，并对其进行病理诊断与Scheuer评分。结果：第2、7、8周，与C组相比，M组与T组大鼠的体重均显著降低（P<0.05）;第7、8周，T组体重均显著高于M组（P<0.05）。与C组相比，M组与T组大鼠的肝指数、D-LA、ET、TNF-α、ALT、AST均显著升高（P<0.05），且T組均显著低于M组（P<0.05）。HE染色结果显示，C组大鼠肝细胞无损伤，M组与T组大鼠肝细胞发生损伤，且T组大鼠肝细胞损伤程度低于M组。三组炎症活动度分级和纤维化程度分期比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中M组的炎症活动度分级与纤维化程度分期均高于T组与C组（P<0.05），而T组与C组炎症活动度分级与纤维化程度分期比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：FMT可以有效保护大鼠肠黏膜屏障功能，缓解炎症，改善肝功能，对酒精导致的大鼠肝损伤具有并保护作用。

【关键词】 粪菌移植 酒精性肝损伤 肠黏膜屏障功能 肝功能

Effects of Fecal Microbiota Transplantation on Intestinal Mucosal Barrier Function and Liver Function in Rats with Alcoholic Liver Injur/XU Guofeng. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： 00-009

[Abstract] Objective： To study the effects of fecal microbiota transplantation （FMT） on intestinal mucosal barrier function and liver function in rats with alcoholic liver injury （ALI）. Method： From April to June 2021， 30 male SD rats were randomly divided into normal control group （group C）， alcohol model group （group M） and FMT treatment group （group T）， with 10 rats in each group. Group C was given equal volume distilled water by intragastric administration and basal feed; group M and group T were given 10 mL/kg of 56° liquor intragastric administration for 8 weeks， from the 5th week， group T was given fecal bacteria solution intragastric administration， and group C and group M were given normal saline. Physiological indexes （body weight， liver index） and blood related indexes （D-LA， ET， TNF-α， ALT， AST） were measured and compared， and liver tissue was stained with HE， the pathological changes of liver tissue under light microscope were observed， and the pathological diagnosis and Scheuer score were performed. Result： At the 2th， 7th and 8th weeks， compared with group C， the weight of rats in group M and group T decreased significantly （P<0.05）; at the 7th and 8th weeks， the weight of group T were significantly higher than that of group M （P<0.05）. Compared with group C， the liver index， D-LA， ET， TNF-α， ALT and AST in group M and group T were significantly higher （P<0.05）， and those in group T were significantly lower than those in group M （P<0.05）. The results of HE staining showed that there was no damage to hepatocytes in group C， and hepatocytes were injured in group M and group T， and the degree of hepatocyte damage in group T was lower than that in group M. There were statistically significant differences in inflammatory activity grade and fibrosis stage among the three groups （P<0.05）; the inflammation activity grade and fibrosis stage of group M were higher than those of group T and group C （P<0.05）， and there were no significant differences in inflammatory activity grade and fibrosis stage between group T and group C （P>0.05）. Conclusion： FMT can effectively protect the intestinal mucosal barrier function， alleviate inflammation， improve liver function， and protect the liver injury induced by alcohol.

[Key words] Fecal microbiota transplantation Alcoholic liver injury Intestinal mucosal barrier function Liver function

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.002

长期大量饮酒可导致不同程度的酒精性肝损伤（alcoholic liver injury，ALI），进而导致酒精性肝炎、肝纤维化，最终演变成肝硬化，目前，ALI的发病率与死亡率在不断增加，研究显示，全球（1 500～

2 000）万人存在酗酒情况，而其中有10%～20%的人存在不同程度上的酒精性肝病[1-2]。随着肠-肝轴学说的提出以及对肠道微生态研究的进一步深入，肠黏膜屏障功能在ALI发病过程中的作用越来越受到重视，粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）疗法成为当下研究的一大热点[3-6]。研究表明，酒精可导致肠道微生物群失调，肠道细菌过度生长和致病菌移位，而正常的肠道菌群是肠道天然的生物屏障[7-8]。因此，在ALI患者的治疗中应考虑寻求恢复肠内微生物稳态的治疗方法。本研究通过建立大鼠ALI模型，探究FMT对大鼠肠黏膜屏障功能及肝功能的影响，来评价其对大鼠ALI的治疗保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 粪菌液制备 于清晨称量5 g正常对照的大鼠粪便，加入50 mL 0.9%氯化钠溶液中搅拌;获得悬液后，使用双层无菌纱布进行过滤;将过滤后的悬液进行离心，去掉上层清液，再次加入50 mL 0.9%氯化钠溶液溶解，获得无色无味的粪菌液[9]。

1.1.2 实验动物 30只SPF级SD大鼠，雄性，8周龄，购于苏州西山生物技术有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-00014。

1.1.3 主要实验试剂 56°白酒购自北京顺鑫牛栏山酒厂;奥美拉唑镁肠溶片（生产厂家：阿斯利康制药有限公司，批准文号：国药准字J20130093，规格：20 mg）;乌拉坦（生产厂家：齐鲁制药有限公司，批准文号：国药准字H37022259，规格：0.5 g），用0.9%氯化钠溶液溶解乌拉坦制成20%乌拉坦注射液;苏木素染液、伊红染色液、Scott蓝化液、超净高级封片胶均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ALI大鼠动物模型的建立与分组 于2021年4-6月取成年雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，大鼠适应性饲养3 d后，将其随机分为三组，每组10只。正常对照组（C组）给予等容量蒸馏水灌胃，基础饲料饲养;酒精模型组（M组）和FMT治疗组（T组）按10 mL/kg，给予56°白酒灌胃，持续8周。第5周开始，T组给予粪菌液灌胃，2 mL/次，隔日一次;C组及M组同时给予生理盐水2 mL/次，在灌胃的前1 d晚上及当天早上均给予奥美拉唑镁肠溶片灌胃（10 mg/kg），以提高胃内pH值。于喂养第8周末腹腔注射20%乌拉坦注射液（6 mL/kg）麻醉后采血处死各组大鼠，留取实验标本。建模和分组方法参考文献[10]。

1.2.2 生理学指标观察 记录各组大鼠的体重变化;在处死大鼠后，剖检取出肝脏进行称量，并计算肝指数。肝指数（%）=肝重（g）/体重（g）×100%。

1.2.3 血液相关指标检测 FMT治疗结束后，空腹12 h，麻醉后取腹主动脉血制备血清及10%肝组织匀浆，采用改良的酶学分光光度法检测血浆D-乳酸（D-LA）;采用终点显色法鲎试验技术检测血浆内毒素（ET）;采用ELISA技术检测血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平;采用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）。

1.2.4 病理剖检 处死动物后，经腹主动脉取血后暴露肝脏，留取肝左叶相同部位的肝组织约5 mm×5 mm×5 mm两块，生理盐水漂洗干净，滤纸吸干水分后，一块立刻置于液氮罐中冷冻备用，另一块置于盛有10%多聚甲醛溶液的标本瓶中备用。

1.2.5 HE染色 将各组大鼠的肝脏组织标本按常规包埋，制作石蜡切片，经HE染色处理后，光镜下观察肝脏组织病理学改变情况。

1.2.6 肝臟病理诊断评分 采用Scheuer评分对各组大鼠的肝脏病理损伤情况进行评分。按炎症活动度不同分为5级：G级，门管区周围无或轻度炎症，小叶内无炎症;G级，门管区周围炎症，小叶内有炎症但无坏死;G级，门管区周围轻度碎片状坏死，小叶内有点灶状坏死或嗜酸小体;G级，门管区周围中度碎片状坏死，小叶内有重度灶坏死;G级，门管区周围重度碎片状坏死，小叶内有桥接坏死。按纤维化程度不同分为5期：S期，无纤维化;S期：门管区扩大;S期，门管区周围纤维化，小叶结构保留;S期，纤维化伴小叶结构紊乱，无肝硬化;S期，肝硬化[11]。

1.3 统计学处理 所有数据处理均采用SPSS 23.0软件进行统计分析，结果以（x±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料以率（%）表示，等级资料采用Kruskal-Wallis H检验进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及生理学指标检测结果 造模期间，各组大鼠的饮食与粪便均正常，未出现呼吸道或消化道等其他疾病。第2、7、8周，M组与T组大鼠体重均显著低于C组，差异均有统计学意义（P<0.05）;第7、8周，T组大鼠体重均显著高于M组，差异均有统计学意义（P<0.05）。M组与T组大鼠肝指数均显著高于C组，且T组显著低于M组（P<0.05）。见表1。

2.2 血液相关指标检测结果 M组与T组大鼠的D-LA、ET、TNF-α、ALT与AST水平均显著高于C组，差异均有统计学意义（P<0.05）;T组大鼠的D-LA、ET、TNF-α、ALT与AST水平均显著低于M组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 HE染色结果 C组大鼠肝组织以中央静脉为中心向周围放射状排列，结构完整;M组可以看到肝细胞深染固缩，组织内有大小不等的脂肪滴及炎症细胞，组织结构紊乱;与M组比较，T组未见明显的脂肪细胞及炎症细胞，病理病变得到改善。见图1。

2.4 肝脏病理诊断评分结果 对各组大鼠肝脏切片进行病理诊断评分，结果显示，三组炎症活动度分级和纤维化程度分期比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中M组的炎症活动度分级与纤维化程度分期均高于T组与C组（χ=2.399、3.358，P=0.049、0.002;χ=3.590、4.488，P=0.001、0.000），而T组与C组炎症活动度分级与纤维化程度分期比较，差异均无统计学意义（χ=0.959、0.369，P>0.05）。见表3。

3 讨论

肠道血液可通过门静脉系统汇集至肝脏，从而使肝脏与肠道产生联系，形成肠-肝轴。近年来，随着对肠-肝轴的研究不断深入，肠黏膜屏障在ALI发生和发展过程中的重要作用被不断提出[12-13]。肝脏是机体代谢酒精的主要场所，早期研究表明，ALI的发病机制在概念上可分为乙醇介导的肝损伤，损伤引起的炎症免疫反应，以及肠道通透性和微生物群的变化，表明长期大量饮酒会导致肠黏膜屏障受损，肠道菌群失调[14-15]。D-LA是α-羟基丙酸，当肠黏膜屏障被破坏时，肠黏膜通透性增加，肠道中的细菌会大量繁殖并产生D-LA，导致血液中的D-LA水平升高;同时，肠黏膜屏障被破坏，还会引起肠源性内毒素血症，过量的ET通过肠-肝轴转移进入肝脏与血液循环，可促发严重的炎症反应与肝脏损伤[16-17]。肝脏Kupffer细胞（KC）是机体产生TNF-α的主要部位，相关研究表明，激活的KC产生的TNF-α、IL-6、IL-1β等与ALI发展具有密切相关性[18-19]。ALT与AST是评价肝细胞损伤的灵敏指标，可以反映肝细胞受损或坏死程度，当肝脏受损时，ALT与AST大量释放进入血液，引起不同程度的增高。

FMT是指将健康者的粪便菌群移植到患者肠道内，从而重建肠道正常菌群的方法。近年来，FMT作为解决与肠道微生物群失衡有关的肠内和肠外各种疾病的有效方法而受到广泛关注[20-22]。相关研究表明，人类肠道微生物群具有抗炎及免疫调节的作用[23]。为了进一步对FMT治疗大鼠ALI效果深入研究，本研究对SD大鼠建立ALI动物模型，随机分为C组、M组和T组，结果显示，M组与T组大鼠的体重较C组均显著降低（P<0.05），而肝指数、D-LA、ET、TNF-α、ALT、AST均显著升高（P<0.05），表明ALI大鼠模型建模成功。进一步分析显示，T组大鼠的肝指数、D-LA、ET、TNF-α、ALT、AST均显著低于M组（P<0.05）。此外，病理诊断作为肝病确诊的“金标准”，因此本研究分别对各组大鼠的肝组织进行病理诊断与Scheuer评分，病理切片结果显示C组大鼠肝组织无损伤，M组与T组大鼠肝索紊乱，且M组可见脂肪滴与炎症细胞，表明T组大鼠肝细胞损伤程度低于M组，对各组大鼠进行的Scheuer评分结果也显示，M组的炎症活动度分级与纤维化程度分期均高于T组与C组（P<0.05），而T组与C组炎症活动度分级与纤维化程度分期比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。进一步表明，FMT对大鼠ALI具有积极的治疗作用，对于大鼠各项指标均有显著改善作用。

综上所述，经过FMT治疗的ALI大鼠肠黏膜屏障功能、肝功能得到有效改善，炎症得以缓解，表明FMT對ALI大鼠具有积极的治疗作用，因此，FMT可作为ALI的潜在治疗选择进一步深入研究。

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（收稿日期：2021-12-21） （本文編辑：张爽）