超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法快速筛查食物中有毒化合物

郑凤家，焦燕妮，张小红，刘俊丽，邵立君，王晓琳，王林，杨路平

（1.山东省预防医学研究院，山东省疾病预防控制中心，济南 250014； 2.滨州市疾病预防控制中心，山东滨州 256618）

食物中毒是指健康人经口腔摄入正常数量、可食状态的有毒食物（指被致病菌及其毒素、化学毒物污染或含有毒素的动植物食物）后所引起的以急性感染或中毒为主要临床特征的疾病[1-4]。虽然政府监管部门、食品生产加工企业、餐饮单位以及消费者都十分重视和关注，但发生食物中毒和误食有毒物质造成中毒甚至死亡的案例仍时有报道。食物中毒因具有突发性、无规律性、危害严重性和防控难度大等特点得到各级政府的高度重视[5-6]。

引发食物中毒的常见物质主要有鼠药[7]、重金属、农药残留[8]、兽药残留、生物毒素[9]、真菌毒素[10]及非法添加物等。目前有机类毒物的检测主要采用色谱法和液相色谱-串联质谱法[8，11-12]等。由于食物中毒具有突发性和未知性，上述检测方法不足以有效地对未知目标物进行定性，而超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-QTOFMS）具有高分辨率、高准确度、高灵敏度、高通量的特点[13-15]，一次进样，不仅可以获得准确的一级质谱信息，还同时获得检出物质的二级质谱（MS/MS）精确质量质谱图。将物质的化学式与一级精确质量质谱图进行对比、MS/MS 精确质量质谱图与标准质谱库或文献比对，在不需要标准物质的情况下可完成对未知毒物的准确定性。

2018 年1 月，山东某村居民在食用了本村磨坊新磨玉米面、豆面后，陆续出现恶心、头晕、头疼、呕吐和乏力等症状，其中一人出现昏迷。笔者对该县疾控中心提供的豆面、玉米面及中毒人员血样，采用基于QuEChERS 原则的净化处理技术，用UPLCQTOF MS/MS 法进行了定性筛查分析，在样品中检出聚醚类抗生素莫能菌素，为中毒人员的医治提供了依据，为抢救病人赢得了宝贵的时间。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

超高效液相色谱仪：ACQUITY UPLC-HCLASS 型，美国沃特世科技有限公司。

飞行时间质谱仪：SYNAPT G2-S QTOF 型，美国沃特世科技有限公司。

涡旋混匀器：Vortex-Genie2型，美国科学技术有限公司。超纯水系统：Millipore-Q型，美国密理博公司。电子天平：Sartorius CPA225D 型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

高纯氮气：体积分数为99.999%，英国毕克科技有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克集团。

甲酸：优级纯，德国默克集团。

待测样品：中毒患者就餐可疑食物4 份（豆面2份，玉米面2 份），中毒人员血样2 份，山东省某县级疾病预防控制中心。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司）；柱温：30 ℃；流量：0.3 mL/min；进样体积：5 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B 为0.1%甲酸-甲醇溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～0.5 min 时，B 相体积分数为5%，0.5～7 min 时，B 相体积分数由5%线性升至95%，7～9 min 时，维持B 相体积分数为5%。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离离子源（ESI）；分辨率：大于20 000；检测方式：正负离子模式检测；质量扫描范围：100～1 200 Da；毛细管电压：0.8 kV；锥孔电压：25 V；离子源温度：120 ℃；脱溶剂温度：400℃；锥孔气：高纯氮气，流量为20 L/h；脱溶剂气：高纯氮气，流量为800 L/h；扫描时间：0.2 s；MSE低碰撞能量：4.0 V；MSE高碰撞能量：10～45 V；质量范围：50～1 200 Da；Lock Spray 双喷雾离子源：亮氨酸脑啡肽溶液；在Lock Spray 模式下：ESI+为556.277 1 Da，ESI-为554.262 0 Da。

1.3 样品处理

血浆样品：吸取100 μL 血浆，加入400 μL 乙腈，涡旋振荡30 s，以10 000 r/min转速离心5 min，取上清液，待测。

食物样品：称取1.00 g 样品（精确至0.01 g）于10 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中，加入含0.1%甲酸的甲醇-水（体积比为7∶3）溶液，涡旋混匀，超声振荡提取5 min。以10 000 r/min 转速离心5 min，取上清液1 mL 于含有30 mg 乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）的Eppendorf 管中净化，涡旋振荡30 s，以10 000 r/min转速离心5 min，取上清液，待测。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法选择

应急事件处置需要时效性，由于中毒样品基体复杂，要求前处理方法快速、准确、高效。在分散固相萃取中，基于QuEChERS 原则的样品处理技术近几年发展格外迅速，适用于各种分子结构和极性化合物的提取净化，已广泛应用于水果、蔬菜中多种农药残留的检测。

依据笔者多年突发性食品中毒事件及食品风险监测工作的经验，发现基于QuEChERS 原则的样品处理技术不仅在复杂基质中具有较好的提取效率，而且最突出的优势在于其处理方法简单、快速，非常适用于突发性公共安全事件的检测，故选择基于QuEChERS 原则的样品处理方法。

基于QuEChERS 原则的样品处理方法一般使用PSA 吸附去除样品基质中的有机酸、色素、糖、脂肪酸等物质，GCB（石墨炭黑粉）去除甾体、叶绿素、类胡萝卜素等化合物，C18去除基质中的脂类等非极性有机物。本次中毒样品为玉米面和豆面，含有大量的色素和脂类，在实验中发现PSA 能够有效去除其中的色素、糖和脂肪酸，有效降低基质干扰，快速筛查出中毒目标物；GCB 操作较复杂，去除糖、脂肪的能力弱于PSA；C18在去除脂类方面具有优势，但是在吸附色素、糖的能力上弱于PSA。综合考虑，选用PSA 作为净化试剂。

2.2 色谱条件优化

C18色谱柱在化合物分离中通用性较强，而Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）对多数化合物均具有较好的分离能力，可以满足多种化合物同时检测的要求，故选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱为分离柱。

在正离子模式质谱分析条件下，流动相水相中加入体积分数为0.1%的甲酸溶液，甲酸能够提供氢离子，不仅能够改善色谱峰形，同时能够提高电离效果。在有机相的选择中，比较了乙腈和甲醇的分离效果，两者差别不大，考虑低毒性、低耗材的因素，选择甲醇作为有机流动相。经优化，选择的流动相体系A 相为0.1%甲酸水溶液，B 相为0.1%甲酸-甲醇溶液。由于中毒样品测定的未知性，选择95%水相线性梯度过度到95%有机相的洗脱方式，以保证筛查结果的完整性。

2.3 质谱模式选择

为提高筛查、鉴定的准确性和可靠性，希望得到样品中各组分的碎片离子，同时又不希望损失其准分子离子的灵敏度。采用非信息依赖型数据采集模式即UPLC/MSE正负离子模式，同时采集2 个不同碰撞能量通道的数据，低能量通道监测准分子离子，高能量通道采集碎片离子数据，一次进样可以得到样品中所有化合物的一级质谱和二级质谱的精确质量数。分别记录母离子及碎片信息，MSE通过母离子与其碎片离子具有相同色谱行为的特性进行母离子与子离子的关联归属，所有的离子信息都被记录，定量、定性更加准确，全部母离子与碎片离子信息都是高精度、高分辨的质谱数据。MSE并不选择特定母离子进行单独碎裂，而是同时采集了所有母离子的碎片离子，这样MSE就避免了数据依赖型串联质谱法因采集速率的限制而造成信息采集不全的问题，故选择在MSE 正离子模式下进行测定。

采集的玉米面、豆面、及血液样品的总离子流色谱图、质谱图分别如图1、图2 所示，其中有效的化合物信息提取较为困难。

图2 玉米面样品质谱图

2.4 确证检出的目标化合物

在血液样品的总离子流色谱图（如图3）中，未观察到信噪比高的色谱峰；对比玉米面与空白玉米面总离子流色谱图（如图4），也无法获取有效信息，这反映了生物基质复杂、毒性化合物浓度一般较低、其信号经常被噪音掩盖的特点。

图3 血液样品的总离子流色谱图

图4 空白玉米面的总离子流色谱图

首先采用非信息依赖型数据采集模式即不需对样品中的化合物进行预选择，而是采集所有从色谱中分离出的化合物质谱信息，数据采集后结合本实验室依托山东省医药卫生科技发展计划（2015WS 0273）建立的动植物源性食品中兽药、农药及违禁添加高通量筛查与检测平台对样品进行数据处理，通过峰提取、母子离子峰精确质量对比、保留时间、化合物加合方式等内置算法，将化合物的相关质谱信息从海量的质谱数据中提取出来，并进行谱库检索。在玉米面样品中检出了莫能菌素，其精确质量数与数据库信息符合(±5 μg/g) ，即在5.96 min处发现了m/z 669.4209离子的一个明显色谱峰，如图1 所示。

使用MassLynxTM应用管理系统元素组成工具，即Elemental Composition，对离子（m/z）669.420 9进行分析，最有可能的建议化学式为C36H61O11，最大质量偏差小于2.1×10-6，并且通过使用智能匹配将该化学式选定为最佳拟合，该化学式与一种畜禽专用抗生素聚醚类抗生素莫能菌素相匹配。对5.96 min 采集的质谱使用MassFragmentTM工具进行处理，分析结果与莫能菌素的母离子（m/z）669.420 9及子离子（m/z）637.353 8相匹配，通过高能通道采集碎片离子图谱，可以清楚直观地得到化合物特征性的碎片离子色谱峰及化学键断裂位置。

参照欧盟指令2002/657/EC 的规定，使用高分辨串联质谱确认的一个母离子计2 分，一个子离子计2.5 分，对目标物质的定性要求为4 分。本实验中对莫能菌素的确认，达到了4.5 分，且满足指令中规定的相对分子质量偏差小于5.0×10-6和绝对质量数偏差为2.0 mDa时保留时间偏差为0.15 min的要求。

经现场调查，磨坊在磨玉米之前磨过鸡饲料（添加剂），初步怀疑患者为饲料中添加的药物中毒。经UPLC-Q TOF-MS/MS 检测分析，在玉米面和豆面及中毒患者血浆中均检出高浓度的莫能菌素，在全面检索筛查质谱数据后，排除了其它化合物可能造成的中毒，确认为莫能菌素。为进一步确认筛查结果，取莫能菌素标准品，配制成标准溶液并进样分析，其UPLC 保留时间以及一级和二级质谱数据与玉米面、血浆样品中的数据一致，玉米面样品、血浆样品、莫能菌素标准品扣除背景后的色谱图如图5所示，对应质谱图如图6，三者基本吻合，从而证实样品中含有莫能菌素。

图5 玉米面、血浆样品、莫能菌素标准品扣除背景后的色谱图

图6 玉米面、血浆样品、莫能菌素标准品MS/MS 质谱图

3 结语

超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法分离效率高、定性准确，尤其在缺少标准品的情况下，以精确质量数定性，也可定量。基于QuEChERS原则的样品处理技术，该法在应急事件快速筛查和鉴定中，能够为突发性食物中毒事件的快速筛查检测提供有力的分析平台，具有一定的应用价值。