基于网络药理学探讨大黄治疗溃疡性结肠炎的机制

潘 威

辽宁中医药大学附属第三医院，辽宁 沈阳 110003

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性炎性疾病，其病因不明确，属疑难杂症，近年来发病率逐渐上升，任何年龄均可发病，老年人发病率高[1-3］。UC好发于结、直肠，表现为结、直肠黏膜连续性弥漫性炎症，周期性交替发作，病程迁延反复。主要症状为腹痛、腹泻及黏液脓血便，出血严重可导致贫血、营养不良等全身症状，部分可能发展为结肠癌[4-5］。目前世界范围内尚无治疗UC 的指南或共识，临床多应用美沙拉嗪、巴拉西亭、类固醇等药物进行治疗，此外还有替代补充疗法，如粪便移植、益生菌移植等[6-9］。但此类疗法容易发生并发症，且存在一定选择标准、安全性等问题[10-11］。

溃疡性结肠炎属于中医学“久痢”“休息痢”等范畴。《素问·太阴阳明论篇》云：“大肠属腑，泻而不藏，多实多热。”[12］《东垣十书》中阐述：“夫肠澼者，为水谷与血另作一派……时值长夏，湿热大盛……而主气弱，故肠澼之病甚。”[13］UC 在临床上多表现为热证，是由于大肠湿热、热毒所导致的里急后重、肛门灼热等症状[14-15］。医学家多应用清解法，大量应用大黄、黄连等苦寒坚阴药物来清利大肠湿热，效果颇佳[16-17］。近年来，以大黄组方的方剂如大黄牡丹汤等广泛应用于临床，获得了满意的效果[18-19］。大黄中含有多种化学成分，对于哪些成分通过什么途径发挥治疗UC 的作用研究较少，本研究基于网络药理学探讨大黄治疗UC 的有效化学成分及作用靶点、途径，以期探索大黄对UC的作用机制。

1 资料与方法

1.1 筛选关键化学成分通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php）检索大黄的全部有效成分，共收集92 种化合物，再通过口服生物利用度（oral bioavail-ability，OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18，对化合物的药物动力学进行筛选，其中，OB是指药物经口服给药后被机体吸收进入血液循环的相对量和速率；DL 反映化合物中特定的功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。

1.2 筛选大黄-溃疡性结肠炎共同作用靶点利用TCMSP数据库搜索大黄关键化学成分的靶点信息，并通过UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）查询与靶点相对应的人类基因名称，再与通过GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）筛选出的溃疡性结肠炎的蛋白靶点基因进行映射，得到药物-疾病靶点基因。

1.3 药物-关键化学成分-疾病靶点的网络可视化为了研究大黄治疗溃疡性结肠炎的作用机制，本研究将大黄-溃疡性结肠炎的共同化学成分和共同蛋白靶点基因导入Cytoscape3.7.2 软件进行可视化处理，在药物-关键化学成分-疾病靶点以网络图的形式呈现出来。在这个网络图中，键化合物和靶点以节点表示，节点之间相互作用的关系以边来表示。

1.4 PPI 网络构建PPI 即蛋白间相互作用关系（protein-protein interaction）的网络将大黄与溃疡性结肠炎的共同靶点基因导入STRING数据 库（https：//string-db.org/Version 10.5），选择研究物种为人类（homo sapiens），得到蛋白互作关系网络，将蛋白关系评分设为0.7，并隐藏出现的游离蛋白，下载PPI 蛋白互作关系图，并筛选排名前15的PPI网络核心基因。

1.5 GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析通过Bioconductor 数据库（http：//bioconductor.org/bioc Lite.R）查询药物-疾病共同靶点基因的基因ID。利用R 语言安装Bioconductor 平台相关安装包，设置pvalue=0.05，qvalue=0.05 进行GO富集分析和KEGG富集分析，输出结果并绘制barplot柱状图。

2 结果

2.1 大黄中化学成分的筛选通过TCMSP 数据库获得大黄的有效化合物共92 种，再经OB≥30%，DL≥0.18 标准进行筛选，得到大黄的有效化合物16 种，包括大黄酸、芦荟大黄素、儿茶素、β-谷固醇、泽兰黄醇、决明内酯等。见表1。

表1 大黄中的有效化学成分

2.2 药物-疾病靶点预测通过TCMSP 数据库查询大黄有效化合物的靶点信息，通过UniProt 进行基因ID的注释。通过GeneCards和OMIM数据库搜索UC的靶点基因，输入“Ulcerative colitis”，获取相关性评分大于5的基因共945个，将大黄与UC 的靶点基因进行映射，得到大黄-UC 的共同靶点共25个，并通过R语言绘制venn图，见图1。记录共同靶点所对应的大黄关键化合物，最终得到大黄-UC 的关键化学成分共6 个，分别为大黄酸、芦荟大黄素、儿茶素、β-谷固醇、泽兰黄醇、决明内酯。大黄-UC 的共同靶点基因分别为NOS2、PTGS2、ESR2、PRSS1、KDR、PTGS1、JUN、ESR1、CHEK1、SLC6A4、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、PON1、CDKN1A、TNFSF15、FASN、PCNA、MYC、IL1B、PRKCD、CCNB1、PPARG。见图1。

2.3 药物-关键化学成分-疾病网络的构建通过Cytoscape 3.7.2 软件将药物-关键化合物-疾病-靶点基因网络进行可视化处理，见图2。

2.4 PPI 蛋白互作网络分析将大黄-UC共有的25个靶点基因导入STRING数据库平台，研究物种选择人类，获取蛋白质相互作用关系，筛选评分＞0.4的蛋白关系，并绘制蛋白互作关系网络图。该网络包括25个节点，102条边，其中评分≥0.98的互作蛋白为CASP8-CASP3、CDKN1A-PCNA、MYC-CDKN1A、BCL2-CASP8、CASP8-CASP9、CDKN1A-CCNB1、MYCJUN、MYC-ESR1、CDKN1A-JUN、CDKN1A-CASP3。这些蛋白之间的相互作用在网络中非常重要，通过计算每个基因连接节点的数目，找出前15个PPI核心基因，为MYC、CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、CASP8CASP 9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、NOS2、BCL2。这些即为大黄治疗UC 的核心基因，见图3—4。

2.5 GO 功能富集分析GO 富集分析结果显示共获得43条GO生物学过程，排名靠前的生物学功能主要为半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程（3个靶点CASP9/CASP3/CASP8）、雌激素受体结合（3个靶点ESR1/PCNA/PPARG）、肿瘤坏死因子受体超家族结合（3 个靶点CASP3/CASP8/TNFSF15）、核受体活性（3 个靶点ESR2/ESR1/PPARG）、转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA 结合（3 个靶点ESR2/ESR1/PPARG）、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性（3 个靶点CASP3/CDKN1A/CCNB1）、泛素样蛋白连接酶结合（5 个靶点JUN/BCL2/CASP8/CDKN1A/CCNB1）、类固醇激素受体活性（3 个靶点ESR2/ESR1/PPARG）、BH 域绑定（2个靶点BCL2/BAX）、死亡域结合（2个靶点BCL2/BAX），说明大黄可以通过多种生物学调控过程发挥治疗UC的作用。见图5。

2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路富集分析结果显示，半夏治疗直肠癌的关键基因靶点主要富集的通路有17条，主要通路涉及p53信号通路、多种凋亡通路、铂耐药通路、细胞凋亡通路、细胞周期通路、VEGF 信号通路、细胞衰老通路、坏死性通路、ErbB 信号通路、MAPK 信号通路、NF-κB 信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等，见图6。

3 讨论

肠道微环境对机体发挥着多种重要的生理调节作用，肠道菌群的抗原对肠道内的免疫细胞具有一定的刺激作用，可以刺激产生多种细胞因子，其中促炎因子与抗炎因子之间的动态平衡维持着肠道以及整个机体的稳态。有研究发现，UC 患者在发病过程中，上述细胞因子之间的平衡被打破，肠道微生态发生混乱[20-21］。大黄分布于陕西、甘肃、四川等地，为蓼科大黄属，味苦、性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具有泻火、清热解毒、活血祛瘀、利水、清化湿热的功效。《本草纲目》云：“主治下痢亦白，里急腹痛，小便淋沥，实热燥结，潮热谵语，黄疸，诸火疮。”[22］大黄含有芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚等化合物，主治腹痛、泻痢不爽、肠痈疔疮等。

本研究中，共检索出大黄治疗UC 的关键化合物6 种，包括大黄酸、芦荟大黄素、儿茶素、β-谷固醇、泽兰黄醇、决明内酯。大黄酸又名大黄苷，具有免疫抑制作用和抗炎作用，大黄酸能抑制机体产生抗体，有研究表明它能减轻免疫器官的质量，降低机体白细胞数目，此外，大黄酸还具有抗肿瘤、抗菌、利尿的作用[23-24］。芦荟大黄素是大黄的有效抗菌成分，对葡萄球菌、炭疽、链球菌、痢疾杆菌等均有强大的抑制作用，其免疫抑制作用能够降低腹腔巨噬细胞的功能，它对肝癌、肺鳞癌、胃癌等肿瘤具有较强活性，抗癌范围广泛，对白血病细胞亦具有抑制作用[25-26］。儿茶素又名儿茶酸，广泛存在于茶叶中，其直接抗菌作用较强，具有广谱性和高效性，能够增强细菌细胞膜的通透性，造成细菌死亡，还可影响细菌的基因表达。有研究发现儿茶素可产生过氧化氢，诱导katB、sodM 等基因上调，增强细胞对氧化应激和DNA 损伤的抵抗作用[27-28］。β-谷固醇通常用于降血清胆固醇，具有解热抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，同时对肺纤维化的损伤具有修复作用[29］。本研究通过PPI蛋白互作分析，得到15 个PPI 核心基因，分别为MYC、CASP3、JUN、ESR1、PTGS2、CASP8CASP9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、NOS2、BCL2。这些即为大黄治疗UC的核心基因。

本研究通过GO 生物学功能富集分析和KEGG通路富集分析靶点在基因功能和信号通路方面作用。上述PPI 核心基因可以通过半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程而起到治疗UC的作用。KEGG通路富集分析结果显示，大黄治疗UC 的靶点基因主要富集的通路涉及p53 信号通路、ErbB 信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt 信号通路等。p53 基因是人体的抑癌基因，能够促进血细胞凋亡，组织细胞周期，它诱导的磷酸酶对机体炎症具有调节作用[30-31］。MAPK 与细胞增殖、免疫调控相关，宿主细胞可通过抑制MAPK来抑制病毒的活性[32］。NF-κB信号通路与调节机体对感染的免疫应答有密切关系，NF-κB的调节作用错误会导致出现炎症、癌症、自身免疫性疾病及感染性休克等，NF-κB 信号通路可激活TNF 通路和IL 通路，后者与机体炎症反应和免疫能力密切相关[33-34］。PI3K-Akt是经典信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能，有研究[35-36］表明，在内毒素症小鼠模型中，PI3K-Akt 信号通路在凝血激活和先天免疫应答中产生了作用，同时与机体内巨噬细胞数量增加有关。有研究显示，HIF-1 可以通过依赖性方式调节细胞因子的平衡，进而控制肠道炎症，HIF-1 的表达与小鼠结肠炎的严重程度密切相关[37］。可见，大黄可以通过抑制炎症反应，改善机体免疫能力的方式治疗UC。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法，阐述了大黄的有效活性成分及靶点基因与UC 作用通路的关系，分析了大黄治疗UC 的复杂作用机制，为未来更深入的实验奠定了基础。