高通量测序技术分析鸭皮中耐热菌群

海丹，乔明武，宋莲军，沈玥，孟静南，黄现青

摘  要：鴨皮作为肉制品中常用的添加原料，其微生物在不同热杀菌处理状态下的多样性研究非常重要。将鸭皮分别在60、70、80、90、100、110、120 ℃条件下热处理后25 ℃恒温放置1 周，通过高通量测序分析鸭皮的微生物多样性情况。结果表明：60 ℃热处理的鸭皮中主要菌属为假单胞菌属（33.52%）和不动杆菌属（18.55%），70 ℃热处理的鸭皮中主要菌属为不动杆菌属（18.46%）、狭义厌氧梭菌属18（12.41%）、变形杆菌属（11.04%）、假单胞菌属（10.17%）、狭义厌氧梭菌属7（8.62%），80、90 ℃热处理的鸭皮中优势菌属为狭义厌氧梭菌属18，相对丰度分别为63.04%和84.11%，100 ℃热处理组优势菌属为芽孢杆菌属（49.50%）、狭义厌氧梭菌属18（29.19%）和厌氧杆菌属（17.20%），110 ℃热处理组优势菌属为芽孢杆菌属（99.23%），120 ℃热处理组优势菌属为狭义厌氧梭菌属18（52.41%）、芽孢杆菌属（33.07%）和狭义厌氧梭菌属7（12.23%）;样品聚类和β-多样性分析表明，温度对鸭皮中的细菌群落组成和丰度差异影响较大。

关键词：鸭皮;细菌多样性;高通量测序;热处理温度;优势菌群

Analysis of Heat Resistant Bacteria in Duck Skin by High Throughput Sequencing

HAI Dan1，2， QIAO Mingwu1，2， SONG Lianjun1，2， SHEN Yue1，2， MENG Jingnan1， HUANG Xianqing1，2，3，4，*

（1.College of Food Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou   450002， China; 2.Henan Engineering Technology Research Center of Food Processing and Circulation Safety Control， Zhengzhou   450002， China; 3.Henan Technology Innovation Center of Meat Processing and Research， Zhengzhou   450002， China; 4.Henan Engineering Research Center of Intelligent Meat Segmentation and Bioconversion， Zhengzhou   450002， China）

Abstract： As duck skin is commonly used a raw material for meat products， studying the microbial diversity in duck skin under different thermal sterilization conditions is vital. In the present study， duck skin was treated at 60， 70， 80， 90， 100， 110 or 120 ℃ and then stored at a constant temperature of 25 ℃ for one week. The microbial diversity of duck skin was investigated by high-throughput sequencing. Analysis of operational taxonomic units （OTUs） showed that the main bacterial genera in duck skin treated at 60 ℃ were Pseudomonas （33.52%） and Acinetobacter （18.55%）; and the main bacterial genera in duck skin treated at 70 ℃were Acinetobacter （18.46%）， Clostridium sensu stricto-18 （12.41%）， Proteus （11.04%） and Pseudomonas （10.17%）， and Clostridium-sensu-stricto-7 （8.62%）. Clostridium-sensu-stricto-18 （63.04% and 84.11% in relative abundance） were found to be dominant in duck skin treated at 80 and 90 ℃; Bacillus （49.50%）， Clostridium sensu-stricto-18 （29.19%） and Anaerosalibacter （17.20%） were dominant in duck skin treated at 100 ℃; the dominant bacteria in duck skin treated at 110 ℃ were Bacillus （99.23%）; the dominant bacteria in duck skin treated at 120 ℃ were Clostridium sensu stricto-18 （52.41%）， Bacillus （33.07%） and Clostridium sensu stricto-7 （12.23%）. Sample clustering and beta diversity analysis showed that temperature had a great influence on the differences in the bacterial community composition and abundance in duck skin.

Keywords： duck skin; bacterial diversity; high throughput sequencing; heat treatment temperature; dominant microflora

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024

中图分类号：TS251.92                 文献标志码：A       文章编号：

引文格式：

海丹， 乔明武， 宋莲军， 等. 高通量测序技术分析鸭皮中耐热菌群[J]. 肉类研究， 2022， 36（5）：  . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024.    http：//www.rlyj.net.cn

HAI Dan， QIAO Mingwu， SONG Lianjun， et al. Analysis of heat resistant bacteria in duck skin by high throughput sequencing[J]. Meat Research， 2022， 36（5）：  . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024.    http：//www.rlyj.net.cn

我國是肉制品生产大国，拥有悠久的肉制品加工历史[1-3]。近些年来，随着食品工业的迅速发展，家禽类成为仅次于猪肉的第二大类消费肉制品[4]。家禽主要有鸡、鸭、鹅等，其中以鸡鸭肉制品最为常见。鸭皮是肉鸭在屠宰过程的副产品，因其富含多种营养成分且可以改变肉制品的色泽、质地、口感等特性[5]而被应用于肉制品中[6]。然而，与发达国家相比，我国对家禽副产品的利用程度和方式比较单一，不同规模的企业对家禽副产品的利用程度和深度不尽相同[7-10]。我国对副产品的利用更多集中在血、毛、头、爪、内脏、骨架等[11]，早期企业对于猪皮、鸭皮、鸡皮的利用都集中在胶原蛋白的提取[12-13]，近年来，食品企业和相关学者加强了对畜禽皮的综合开发利用，为开发新的、多样化的火腿肠，迎合越来越多口味挑剔消费者的需要，伍佰鑫等[14]从湖南长沙某鸭肉加工厂采购宰后48 h的新鲜鸭胸肉和鸭皮，预先磨碎并均质化，添加到火腿肠中，发现鸭皮添加量为30%或40%的鸭火腿品质较优，有效改善了适口性。聂晓开[15]研究北京烤鸭的风味形成原理和西式火腿的成型工艺，使用鸭脯肉作为原料，在单独烤制鸭皮形成烤鸭风味的基础上，制备压缩火腿。在我国，禽类的屠宰加工过程包括：挂禽→电击晕→宰杀→沥血→浸烫→脱毛→胴体体表检查→摘嗉→净毛→去头→开膛→切爪→转挂→掏脏→内脏检验→脏体分离（副产品）→副产品加工→预冷前检验→胴体高压冲洗→预冷减菌→预冷后检验→分割[16]。预冷减菌阶段是禽肉屠宰加工中微生物的关键控制点之一[16]，工厂生产过程中经预冷后能控制鸭肉等产品的微生物生长，在预冷阶段鸭皮原料的微生物数量与后期鸭皮在热处理阶段的初始菌数量密切相关，降低鸭皮中所含的微生物种类及数量对肉制品的安全控制影响重大。

目前，热处理仍是食品工业中常用的杀菌方法，根据其温度的不同，可以分为低、中、高温肉制品，其杀菌温度范围为60～120 ℃，温度不同，杀菌效果不同。细菌种类不同，对热的耐受程度也不同，导致不同热处理的肉制品腐败菌群也可能不同。高通量测序技术中因包含了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）这一步骤，导致不能区分活/死细胞的DNA，从而导致不真实的多样性或过高估计活细胞的数量。而叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）因其具有叠氮基团，在光照下能与死细胞的DNA分子发生共价交联，从而抑制死细胞DNA分子扩增，且PMA不能进入活细胞，与活细胞DNA发生共价交联。基于这一优点，PMA分子被用于处理鸭皮在经过热杀菌后死亡细菌的DNA，从而得到鸭皮中仍存活的细菌群落组成。这对添加热杀菌鸭皮的肉制品杀菌工艺的选择、可能致腐微生物的预防及预测有重要指导意义。因此，本研究通过高通量测序技术对不同热杀菌后鸭皮耐热微生物菌落情况进行分析研究，为企业安全使用鸭皮原料提供数据支撑。

1   材料与方法

1.1   材料与试剂

新鲜的鸭皮取自河南安阳某肉制品企业，选用北京鸭。

NaCl   天津市江天化工技术有限公司;一步式DNA提取试剂盒   北京天恩泽基因科技有限公司;E.Z.N.A.®细菌基因组提取试剂盒   美国Omega Bio-Tek公司;热启动高保真DNA聚合酶试剂盒   北京全式金生物技术有限公司;EX Taq酶   日本TaKaRa公司;PMA   美国Biotium公司;二甲基亚砜   河南比根生物科技有限公司。

1.2   仪器与设备

CFX 96荧光定量PCR仪   美国Bio-Rad公司;FXB303-2电热恒温培养箱   上海树立仪器仪表有限公司;NanoDrop 2000超微量分光光度计、1300系列II级A2型生物安全柜   赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司;5430高速冷冻离心机   德国Eppendorf公司;ABI 9700 PCR仪   美国GeneAmp公司;DYY-6C电泳仪   北京六一仪器厂;Gel DocIt TS3紫外凝胶成像系统   美国UVP公司;SX-500全自动蒸汽灭菌锅   日本Tomy公司;400CC拍击式均质机   法国BagMixer公司;Qubit 2.0 Flurometer荧光光度计   上海Life Technologies公司;2100生物分析仪   美国安捷伦科技有限公司;MiSeq System高通量测序仪   美国Illumina公司。

1.3   方法

1.3.1   样品制备及分组

通过无菌操作对鸭皮取样，从25 kg鸭皮中随机选择24 份鸭皮样品（每份25 g），分别置于无菌袋中并用橡皮带密封，以未经热处理（25 ℃）的样品为对照组，其余样品平分为7 组，每组3 个平行，分别置于60、70、80、90、100、110、120 ℃中进行水浴热杀菌，使用针刺式肉品中心温度计（量程50～300 ℃）直接刺在鸭皮上，当样品的中心温度达到对应温度时，计时10 min。热处理后的样品放入25 ℃恒温培养箱1 周，以实现活菌富集。样品培养1 周后取出，向样品中加入225 mL无菌生理盐水，并在拍打式均质器中匀化120 s，取20 mL匀浆物17 226×g离心10 min收集细菌，弃去上清液，将收集的细菌溶解在500 μL无菌生理盐水中备用。

1.3.2   PMA处理

将1 mg PMA溶于200 μL体积分数20%二甲基亚砜中，制备5 μg/μL的储备溶液，并在-20 ℃下避光保存。使用时，将PMA储备溶液稀释10 倍，用作PMA工作溶液。使用透明的1.5 mL离心管，将10 μL PMA工作溶液加入到500 μL细菌溶液中，至终质量浓度为10 μg/mL。在黑暗中孵育5 min后，使用650 W卤素光源将样品曝光5 min。样品管放置在离光源约20 cm处并水平放置在冰上（以避免过度加热）。偶尔进行摇动以保证光照均匀。在光诱导交联后，17 226×g离心10 min收集细菌。

1.3.3   细菌基因组DNA提取

热杀菌组和未加热组的鸭皮分别装入无菌均质袋中，再加入225 mL灭菌生理盐水后在拍打式均质器中匀化120 s，取20 mL匀浆物17 226×g离心10 min收集细菌。然后使用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA。

1.3.4   16S rDNA文库制备

利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品是否有降解和杂质，通过超微量分光光度计初步检测DNA样品纯度，荧光光度计检测DNA样品浓度，检验合格的DNA（A260 nm/A230 nm大于1.2，质量浓度20 ng/µL）进行PCR扩增。PCR实验采用热启动高保真DNA聚合酶，20 µL反应体系：5×FastPfu Buffer 4 µL、2.5 mmol/L dNTPs 2 µL、上游引物（5 µmol/L）0.8 µL、下游引物（5 µmol/L）0.8 µL、FastPfu 聚合酶0.4 µL、牛血清白蛋白0.2 µL、模板DNA 10 ng，ddH2O补至20 µL。PCR扩增使用的引物为上游引物：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）、下游引物：805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）。PCR反应参数：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸40 s，35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。为确保扩增效率和准确性，使用EX Taq酶。扩增结束后对扩增的目的片段进行富集，然后加入1 µL特异Index序列，建库流程如图1所示。完整的文库结构包含P5、i5Index（Index2）、i7Index（Index1）和P7，其中P5、P7接頭位于文库两端，Index是用于文库混合测序时区分不同样本的标签，是测序文库的唯一识别码。

1.3.5   库检及测序

文库构建完成后，先使用荧光光度计进行初步定量，稀释文库至1 ng/µL，随后使用生物分析仪对文库的插入片段进行检测，所插入片段符合预期后，使用荧光定量PCR仪及相关的荧光定量检测试剂盒进行扩增，对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。检测合格的文库采用HiSeq进行测序，测序模式、通量及质量选择PE250模式。检测合格的文库，采用高通量测序仪进行测序。

1.3.6   数据过滤

测序得到的某些原始序列会含有测序接头序列及低质量序列，为了保证信息分析数据的质量，对原始序列进行过滤，得到高质量的Clean Reads，用于后续分析。

1.3.7   序列拼接

对过滤后的序列，采用PEAR序列拼接算法将双末端测序序列根据末尾的重叠情况合并成一条序列，再进行下一步分析。PEAR程序可以合并来自可变长度靶片段的原始Illumina双端Reads。该程序评估了所有可能的双端Reads重叠，不需要靶片段大小作为输入，而且还通过统计检验减少假阳性概率。在模拟数据和实际数据上的测试显示，PEAR可以高度准确地对双端Reads进行合并。

1.3.8   数据处理

测序得到的序列，使用Flash和Trimmomatic软件进行生物信息学分析，包括进行质量控制、去除前后引物和条形码得到有效序列，然后使用Uparse软件（vsesion 7.0，http：//drive5.com/uparse/）对有效序列在97%水平上进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类[17]。在QIIME平台（http：//qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html），采用RDP classifier（version 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析[18]，分别在门、属水平统计各样本的群落组成，与细菌16S rDNA数据库Greengene（Release 13.5，http：//greengenes.secondgenome.com/）对比[19]。利用α-多样性和β-多样性对样品菌群进行评价[20]。选取Shannon、Simpson、Ace、Chao 1指数和覆盖率等指标进行α-多样性分析，其中，Chao1指数和Ace指数反映群落丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映群落多样性。基于Bray-Curtis计算方法，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）法和非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析法进行β-多样性分析。Heatmap图利用R语言Vegan算法计算得到，以颜色梯度表征二维矩阵或表格中的数据大小，并呈现群落物种组成信息[21]，每种处理3 个平行。通过SPSS 18.0软件进行数据间差异显著性分析。

2   结果与分析

2.1   不同热杀菌处理鸭皮DNA序列长度分析

通过16S rDNA高通量测序，8 组样本、24 份样品总共得到1 572 454 条优质序列。对所有样品的优质序列长度进行统计。由表1可知，序列长度多集中于430～450 bp，符合理论值。

2.2   不同热处理条件下鸭皮表面微生物α-多样性分析

由表2可知：不同热处理温度对鸭皮中细菌多样性的影响较大，8 组样本覆盖率均达到99.9%以上，且不存在显著性差异，这表明在当前测序量下能较好反映样本细菌群落的丰富度和多样性;Chao 1指数和Ace指数越高表明群落丰富度越高，60 ℃条件下热处理的样品具有最高的细菌群落丰富度，但与对照组和70 ℃处理的样品之间不存在显著性差异;Shannon指数越大，说明群落多样性越高，而Simpson指数越大，说明群落多样性越低。110 ℃条件下热处理的样品具有最低的Shannon指数和最高的Simpson指数，表明鸭皮中细菌群落的多样性最低。α-多样性分析结果显示，60 ℃热处理的鸭皮样品中观测到的物种数超过对照组，但不存在显著性差异，110 ℃热处理的鸭皮样品中观测到物种最少，但与120 ℃处理的样品不存在显著性差异。

2.3   不同热处理条件下鸭皮表面微生物物种组成分析

由图2可知，在热处理的鸭皮样品中发现的菌门绝大多数均为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。对照组的主要菌门为变形菌门（63.71%）和厚壁菌门（30.17%）;60 ℃热处理组与对照组相比，变形菌门具有更高的相对丰度，高达75.92%，厚壁菌门的相对丰度为22.32%，与对照组相比略有下降;而70 ℃处理组与对照组相比，变形菌门的相对丰度下降，厚壁菌门的相对丰度上升，分别为53.71%和40.75%;当热处理温度大于70 ℃后，厚壁菌门成为最主要的菌门，80、90、100、110、120 ℃热处理组相对丰度分别为97.32%、99.24%、97.86%、99.93%、99.97%）。

由圖3可知，当热处理温度低于80 ℃时，样品中的优势菌属呈现一种较均匀的状态，没有绝对的优势菌属，均由几种菌属共同组成。如对照组中，优势菌属有假单胞菌属（Pseudomonas）（21.94%）、变形杆菌属（Proteus）（20.99%），其次是漫游球菌属（Vogococcus）（11.59%）;60 ℃处理组样品的主要菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）（33.52%）和不动杆菌属（Acinetobacter）（18.55%），其次还有低丰度的变形杆菌属（5.71%）和狭厌氧梭菌属7（Clostridium sensu stricto 7）（6.32%）;70 ℃处理组样品的优势菌属为不动杆菌属（18.46%）、狭义的厌氧梭菌属18（Clostridium sensu stricto 18）（12.41%）、变形杆菌属（11.04%）、假单胞菌属（10.17%）、狭义的厌氧梭菌属7（8.62%）;80 ℃和90 ℃处理组的优势菌属为狭义厌氧梭菌属18，相对丰度分别为63.04%和84.11%;100 ℃处理组的优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）（49.50%）、狭义厌氧梭菌属18（29.19%）和厌氧杆菌属（Anaerosalibacter）（17.20%）;110 ℃处理组的优势菌属为芽孢杆菌属（99.23%）;120 ℃处理组的优势菌属为狭义厌氧梭菌属18（52.41%）、芽孢杆菌属（33.07%）和狭义厌氧梭菌属7（12.23%）。总体来说，对照组及热处理温度低于80 ℃时，样品中的主要菌属较多样，且没有一种绝对优势的菌属;当热处理温度≥80 ℃后，样品中的优势菌属开始倾向于产芽孢的菌属，其中狭义厌氧梭菌属18和芽孢杆菌属最为突出。另外，厌氧杆菌属是厌氧梭菌属（Clostridium）的一个新属，关于它的临床研究尚较少。

2.4   不同热处理条件下鸭皮表面微生物β-多样性分析

为评估鸭皮的细菌群落结构与热处理温度之间的关系，采用PCA和NMDS多元统计方法分析8 组热处理的鸭皮基于属水平的群落结构差异。由图4～5可知，前2 个主成分的累计贡献率为89.94%，8 个热处理组的鸭皮样品主要分为2 组，其中对照组和60、70 ℃热处理的鸭皮样品聚集在一起，这表明60、70 ℃热处理组的处理效果差别不大，80、90、100、110、120 ℃热处理的样品聚集在一起。

2.5   不同热处理条件下鸭皮表面微生物的聚类分析

对样品中相对丰度前20的菌属进行聚类绘制热图。由图6可知，对照组与60、70 ℃处理组样品的优势菌属存在大部分交叠，表明这3 组鸭皮样品中的细菌群落结构基本相似。而80、90、100、110、120 ℃处理组的优势菌属也存在交叠，主要集中在狭义厌氧梭菌18和芽孢杆菌属2 种菌属，这表明高于80 ℃热处理的鸭皮中细菌群落结构有一定的相似性。

3   讨  论

本研究针对热处理温度对鸭皮中细菌多样性的影响研究结果显示，与对照组（25 ℃）相比，60、70 ℃热处理对鸭皮微生物多样性的影响较小，有研究表明，肉类产品热加工过程中复杂介质的物理和化学成分对微生物的杀伤力有影响，其中脂肪对菌株的耐热性起重要作用[23]。也有研究表明，低熔点脂肪在高于其熔点的温度下由固相快速转变为液相，在此期间它能吸收相当多的热能，利用这种相变特性提高了加热过程中益生菌的存活率[24]，这与本实验的研究结果相一致，因此鸭皮所含有大量蛋白质、脂肪等营养物质[22]在60、70 ℃热杀菌条件下对细菌具有保护作用，不能有效降低鸭皮的细菌多样性。大多数食品加工通常在80～100 ℃的温度下对成分进行热处理，保持5～15 min[25]。在此过程中，大多数营养形式的微生物被灭活，但是不足以杀死细菌内生孢子[26]，因此本实验也发现，当热处理温度≥80 ℃时，产芽孢的菌属开始成为优势菌属。一般来说，食物中的孢子在110～130 ℃湿热处理20～40 min可以灭活，有时对于高酸性或冷藏的食品，80～100 ℃下处理10 min也足以使孢子失活[27-28]。这也解释了鸭皮在加热到110～120 ℃时仍有许多细菌能够继续存活下来。尽管更高温度的热处理可有效灭活孢子，但也会对热敏感食物造成不利影响[29]。因此，未来研究出能够有效灭活孢子且对食品质量感官影响最小的处理方法至关重要[30]。

本研究观察到了不同热处理温度对鸭皮中细菌群落组成及多样性的影响，研究结果为添加鸭皮产品的肉制品企业在鸭皮原料安全控制、存贮条件选择、杀菌参数确定、防腐剂复配选择、产品流通条件选择及产品腐败安全风险控制等方面提供了理论依据。然而，本研究没有评估其他环境因子对微生物多样性的影响，这也导致高温热处理的鸭皮中仍能观测到较多物种，没法得到合理解释，此部分在后续研究中需要改进。鸭皮作为添加原料成为脂肪等的替代品，能够有效改善肉制品的色泽、质地、感官等质量指标，且其价格远远低于鲜肉，但由于复杂的环境因素，鸭皮中包含多种细菌，因此企业在使用鸭皮时仍需谨慎。企业选择鸭皮原料的杀菌处理条件时应注意：1）过高的温度不一定能够很有效地除菌;2）最合适的杀菌温度分别为鸭皮中心温度90、110 ℃处理10 min;3）对于热处理后鸭皮的细菌控制，除了加入广谱抑菌剂外，还要着重关注芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属，选取有效的抑菌剂格外重要。

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