急性缺血性脑卒中患者血清miR-433-5p表达水平及其与Hcy及MMP-9的相关性研究

王 景，董 坤，黄 优，陈海恋，林兆信，何超明

（三亚中心医院/海南省第三人民医院神经内科，海南三亚 572000）

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）是严重危害人类生命健康和生活质量的急性脑血管疾病[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类非编码小分子RNA，参与AIS的发生发展[2]。研究表明，miR-433-5p的异常表达与AIS的发生发展密切相关，有望作为AIS诊断的潜在指标[3]。同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）可反映动脉粥样硬化斑块发展程度，参与AIS的组织损伤和炎症反应过程，是AIS发生的主要危险因子[4-5]。本研究通过检测血清miR-433-5p在AIS中表达情况，分析其与Hcy及MMP-9的相关性，探讨miR-433-5p对AIS的诊断价值，有助于指导AIS的诊疗。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年1月～2021年3月在三亚中心医院收治的106例AIS ，其中男性72例，女性34例，年龄37～86（58.12±9.64）岁。纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南（2018年）》[6]诊断标准；②经头颅CT或MRI检查显示缺血性病灶。排除标准：脑外伤及其他脑血管疾病者。根据美国国立卫生研究院卒中量表（national institutes of health stroke scale, NIHSS）评分评估患者的神经功能缺损程度，其中轻度神经功能缺损30例（轻度组，NIHSS评分＜5分），中度神经功能缺损48例（中度组，5分≤NIHSS评分≤20分），重度神经功能缺损28例（重度组，NIHSS评分＞20分）。另选择健康体检正常者60例作为对照组，其中男性42例，女性18例，年龄40～85（59.37±9.10）岁。各组性别、年龄等资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 ABI 7500型荧光定量PCR仪（ABI公司）；PCR试剂盒，逆转录试剂盒和TRIzol试剂盒（Qiagen公司）；AU5800全自动生化分析仪（贝克曼），HCY试剂盒（上海生物科技有限公司），MMP-9试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 miR-433-5p：采集研究对象静脉血3 ml，离心分离血清，应用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-433-5p。上游引物：5’-ATACTGGCATCATGA CTGTAC-3’，下游引物：5’-GC ATCGATGTAACT GTGAGT-3’。PCR总反应体系为20 μl：1 μl引物及探针Mix，10 μl TaqMan通用混合物溶液，1.33 μl反转录产物互补DNA，7.67 μl无核酸酶的水；扩增条件：95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，45个循环。

1.3.2 Hcy及MMP-9检测 ：另采集研究对象静脉血2 ml，使用贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测Hcy水平；采用酶联免疫吸附法测定MMP-9水平。

1.4 统计学分析 SPSS20.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验；组间比较采用t’检验。绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平对AIS的诊断价值。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIS组和对照组血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平比较 与对照组比较，AIS组血清miR-433-p（2.96±0.94 vs 0.81±0.17），Hcy（19.14±5.30μmol/L vs 5.65±1.13μmol/L）及MMP-9水平（151.36±29.75μg/L vs 77.93±11.28μmol/L）升高，差异均有统计学意义（t=16.718, 14.216, 10.152，均P＜0.001）。

2.2 不同神经功能缺损患者血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平比较 见表1。与中度组和轻度组比较，重度组血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平均升高（t=9.847～14.636，均P＜0.05），且中度组血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平均高于轻度组（t=11.713，8.425, 7.732, 均P=0.000），差异均有统计学意义。

表1 不同神经功能缺损患者血清miR- 433-5p，Hcy及MMP-9水平比较（±s）

表1 不同神经功能缺损患者血清miR- 433-5p，Hcy及MMP-9水平比较（±s）

项 目 轻度组（n=30） 中度组（n=48） 重度组（n=28） F值 P值miR -433-5p 1.83±0.57 2.80±0.91 4.36±1.20 12.918 ＜0.001 Hcy（μmol/L） 11.35±3.24 18.20±4.86 29.12±6.48 9.650 ＜0.001 MMP-9（μg/L） 85.27±11.93 140.83±25.64 227.15±48.20 7.934 ＜0.001

2.3 血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平对AIS的诊断价值 见表2和图1。miR-433-5p诊断AIS的AUC为0.851（95%CI：0.792～0.908），高于Hcy（0.756，95%CI：0.695～0.814）及MMP-9（0.698，95%CI：0.637～0.756），差异有统计学意义（Z=6.472，8.151，均P＜0.05），敏感度和特异度分别为89.4%和82.0%。

表2 血清miR- 433-5p，Hcy及MMP-9水平对AIS的诊断价值

图1 血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平诊断AIS的ROC曲线

2.4 miR-433-5p与Hcy，MMP-9的相关性分析 见图2。Pearson相关分析显示，AIS患者血清miR-433-5p表达水平与Hcy及MMP-9均呈正相关（r=0.842，0.714，均P＜0.01）。

图2 miR-433-5p与Hcy，MMP-9的相关性

3 讨论

急性缺血性脑卒中（AIS）是最常见的脑卒中类型，其致残率和死亡率较高，位居全球第二位，早期诊断、早期治疗及早期康复对该病的救治至关重要。目前，关于AIS的早期诊断具有较大的挑战性，仍需要改进AIS的诊断生物标志物。同型半胱氨酸（Hcy）作为人体内的含硫氨基酸，是动脉粥样硬化发生的危险因子，对判断脑卒中预后具有较好的帮助[7]。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种基质金属蛋白酶，通过诱导下游炎性因子，促进氧化应激损伤，参与动脉粥样硬化及脑梗死发生[8]。miRNA是一类内源性非编码RNA分子，可在转录后调节基因表达，参与神经修复、炎症和氧化应激，在AIS发生过程中扮演重要角色[9]。ZHAO等[10]研究指出，miRNA异常表达与动脉粥样硬化斑块的形成及破裂有关，参与脑卒中的发生。

本研究显示，与对照组比较，AIS组血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平升高，重度组血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平均高于中度组和轻度组，说明血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平升高与AIS患者的神经功能缺损的严重程度有关，可能参与AIS的发生发展。以往的研究认为，Hcy水平升高是促进脑卒中患者病情发生及进展的危险因子，对判断脑卒中患者的病情严重程度及预后有很大帮助[11]。ZHENG等[12]研究发现，血清MMP-9水平在AIS患者中明显升高，且与患者的病情严重程度有关，MMP-9对评估脑卒中患者病情进展情况具有一定的价值。另有研究表明，miRNA通过靶向作用于多种蛋白在脑卒中的免疫炎症反应、细胞凋亡及氧化应激反应的过程起了重要的调节作用，可为脑卒中的诊断、治疗及预后提供新的策略[13]。本研究ROC曲线分析显示，血清miR-433-p诊断AIS的AUC高于Hcy及MMP-9，其最佳临界值取1.96时，诊断AIS的敏感度和特异度较高。由此可见，与Hcy及MMP-9相比，miR-433-5p诊断AIS的敏感度和特异度较高，对AIS诊断具有较高的临床应用价值，有望作为AIS诊断的分子标志物。CAO等[14]研究表明，AIS患者存在miRNA差异表达，其对AIS诊断具有很好的前景，未来有望作为AIS诊断的有用标志物。本研究相关分析显示，AIS患者miR-433-5p水平与Hcy及MMP-9均呈正相关，提示miR-433-5p可能与Hcy及MMP-9共同促进动脉粥样硬化形成，在AIS的发生发展中发挥重要作用。因此，我们推测miR-433-5p的高表达可能与AIS发生有关。另有研究认为，miRNA在基因表达和分泌的转录后调控中发挥着重要作用，参与了AIS的发生发展，其作为AIS诊断和预后敏感生物标志物具有巨大的潜力，将为临床上AIS诊疗带来很大的帮助[15]。

综上所述，血清miR-433-5p表达水平在AIS患者中明显升高，且与Hcy及MMP-9水平呈正相关，miR-433-5p有望作为AIS诊断的有用标志物。但本研究的样本例数不多，而且为单中心的临床分析，未来仍需更大样本的多中心研究来证实，使其更好的应用于临床。