非小细胞肺癌患者血浆miR-520f，miR-143-3p表达与病理特征和预后的相关性研究

张玲玲，张小霞，於潇潇，葛 琴（南通市肿瘤医院检验科，江苏南通 226361）

随着非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）研究的不断深入，靶向治疗和免疫治疗逐渐应用于临床，患者生存率得到一定程度提高，但是总体生存率仍然较低，尤其是发生转移的中晚期患者[1]，其5年生存率不到5%[2]。微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）参与细胞分化、增殖、凋亡等调控，在恶性肿瘤中或发挥致癌基因作用或发挥抑癌基因作用[3]。其中miR-520f，miR-143-3p具有抑制癌细胞增殖和侵袭功能，在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用[4-5]。但是miR-520f，miR-143-3p在NSCLC的报道并不多见，其作用机制以及和患者预后的关系尚不明确，鉴于此本研究检测NSCLC患者血浆miR-520f，miR-143-3p表达并分析其临床意义，旨在为病情评估和预后预测提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究已获得南通市肿瘤医院伦理委员会批准，选择2015年1月～2017年1月南通市肿瘤医院收治的81例首次确诊为NSCLC患者（NSCLC组），排除其它类型肺癌；入组前已经接受手术、放化疗治疗；并发其它部位肿瘤、肺结核。男性42例，女性39例，年龄51～72（63.35±4.21）岁，吸烟史（吸烟史定义为每天吸烟20支，烟龄≥20年）51例。另选择62例体检者为对照组，男性38例，女性24例，年龄51～70（63.09±4.17）岁，吸烟史13例。两组年龄、性别、吸烟史比例比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 试剂和仪器 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；SuperScript IV 反转录酶，VeritiPro PCR仪（美国赛默飞公司）；Optima XPN系列超速离心机（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 方法 NSCLC组术前（对照组体检当日）采集肘静脉血，参照刘旭辉等[6]的操作方法，2-ΔΔCt计算miR-520f，miR-143-3p相对表达量，引物序列见表1。采用电话随访方式对NSCLC患者进行定期随访（每3个月一次）和生存状况统计，时间截止2020年9月。自病理确诊至影像学或实验室复查发现的肿瘤复发、转移或全因死亡/随访截止时间为无疾病进展（progression-free survival，PFS）生存时间。自病理确诊至全因死亡/随访截止时间为总体生存（overall survival，OS）时间，统计随访期间NSCLC患者PFS，OS生存率。

表1 引物序列和反应条件

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0进行数据录入和分析，miR-520f， miR-143-3p以均数±标准差（±s）表示，采用Studentt检验；计数资料以例（n）表示，采用χ2检验；绘制NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲线，Log-Rank检验不同miR-520f，miR-143-3p表达下患者生存率差异。COX风险比例回归检验NSCLC患者随访期间死亡的因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组血浆miR-520f，miR-143-3p表达比较成组设计资料的t检验结果显示NSCLC患者血浆miR-520f（1.82±0.32）， miR-143-3p（0.35±0.06）表达低于对照组（2.51±0.49，0.94±0.11），差异具有统计学意义（t=10.160, 40.986，均P＜0.01）。

2.2 血浆miR-520f，miR-143-3p水平与NSCLC患者临床病理特征的关系 见表2。成组设计资料的t检验结果显示TNM分期、淋巴结转移NSCLC患者血浆miR-520f表达低于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者，差异具有统计学意义（P＜0.01），低中度分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移NSCLC患者血浆miR-143-3p表达低于高度分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者，差异均具有统计学意义（均P＜0.01）。

表2 不同临床病理特征患者血浆miR-520f，miR-143-3p表达差异（±s）

表2 不同临床病理特征患者血浆miR-520f，miR-143-3p表达差异（±s）

类 别 n miR-520f t值 P值 miR-143-3p t值 P值性别 男 42 1.67±0.28 1.862 0.066 0.33±0.05 0.817 0.416女39 1.79±0.30 0.34±0.06年龄 (岁) ≥60 46 1.68±0.27 1.919 0.059 0.33±0.04 0.811 0.420＜60 35 1.80±0.29 0.34±0.07吸烟史 有 51 1.70±0.28 1.177 0.243 0.33±0.05 0.807 0.422无30 1.78±0.32 0.34±0.06肿瘤直径(cm) ≥3 35 1.68±0.23 1.545 0.126 0.33±0.04 0.466 0.643＜3 46 1.77±0.28 0.33±0.05病理类型 腺癌 45 1.68±0.25 1.800 0.075 0.33±0.03 1.286 0.202鳞癌 36 1.79±0.30 0.34±0.06分化程度 低中度分化 42 1.69±0.26 1.309 0.194 0.30±0.04 5.035 ＜0.01高度分化 39 1.77±0.29 0.37±0.08 TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期 33 1.89±0.35 4.335 ＜0.01 0.31±0.04 3.349 ＜0.01Ⅲ～Ⅳ期 48 1.62±0.21 0.35±0.06淋巴结转移 是 23 1.52±0.20 4.983 ＜0.01 0.26±0.03 7.604 ＜0.01否58 1.81±0.29 0.36±0.06

2.3 不同血浆miR-520f，miR-143-3p表达NSCLC患者预后差异及PFS，OS生存曲线图 生存分析曲线图见图1,图2。Kaplan-Meier生存分析结果显示低表达miR-520f组（miR-520f＜1.82，n=39）NSCLC患者PFS生存率、OS生存率分别为58.97%（23/39），76.92%（30/39），低 于 高表 达miR-520f组（miR-520f≥1.82，n=42）的90.48%（38/42），95.24%（40/42），差异具有统计学意义（Log Rankχ2=9.270，5.303，P=0.002，0.021）；低表达miR-143-3p组（miR-143-3p＜0.35，n=36）NSCLC患者PFS生存率、OS生存率分别为58.33%（21/36），75.00%（27/36），低于高表达miR-143-3p组（miR-143-3p≥0.35，n=45）的88.89%（40/45），95.56%（43/45），差异具有统计学意义（Log Rankχ2=9.079，6.857，P=0.003，0.009）。

图1 不同血浆miR-520f表达NSCLC患者PFS，OS生存曲线图

图2 不同血浆miR-143-3p表达NSCLC患者PFS，OS生存曲线图

2.4 NSCLC患者终点事件的COX回归分析 见表3。经单因素COX回归分析：肿瘤直径、分化程度、远处转移、TNM分期、淋巴转移、miR-520f，miR-143-3p与NSCLC终点事件有关（均P＜0.05）。多因素COX回归分析：淋巴结转移、miR-520f，miR-143-3p与NSCLC患者终点事件独立相关（均P＜0.001）。

表3 影响NSCLC患者预后的COX回归分析

3 讨论

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）早期症状隐匿，检出率低，确诊时多数已处于中晚期，丧失最佳手术时机，生存状况差[6]，探寻预测NSCLC患者预后的非侵入性指标十分重要。miRNA 是一类非编码小分子RNA，通过特异性识别靶mRNA3’非编码区，导致靶mRNA降解，翻译抑制，转录后调控基因表达，参与恶性肿瘤发生发展，现已发现多种miRNA与NCSLC发病有关 [7-8]。

miR-520f是miR-520家族成员之一，定位于19号染色体，具有调控胚胎干细胞生长、分化作用[9]。miR-520f已被证实参与多种恶性肿瘤发生和进展，体外研究显示敲除胃癌细胞中miR-520f可导致细胞的侵袭性增殖[10]，动物实验结果显示miR-520f过表达可抑制小鼠肺转移[11]。本研究发现NSCLC组miR-520f表达低于健康对照组，且miR-520f表达与NSCLC患者TNM分期和淋巴结转移有关，提示miR-520f在NSCLC中发挥抑癌基因作用。体外研究表明miR-520可调节癌细胞侵袭和转移，下调miR-520f可能减弱细胞凋亡抑制作用，并导致化疗耐药[11-12]。miR-520f可通过靶向调控4跨膜区的L6超家族成员1抑制肝癌细胞增殖和侵袭[13]，也可通过靶向调控去整合素-金属蛋白酶9和Ⅱ型转化生长因子-p受体抑制癌细胞侵袭，在恶性肿瘤中发挥抗侵袭和抗转移作用[11]。本研究统计分析结果显示miR-520f低表达与患者低生存率有关，miR-520f低表达是NSCLC终点事件发生的危险因素，提示miR-520f可以为NSCLC预后评估提供一定参考。

miR-143-3p是miR-143家族成员之一，位于人类基因组5号染色体33位，可调控细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期等，miR-143-3p表达显著降低癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[14]。miR-143-3p已被证实在卵巢癌[14]、骨肉瘤[15]、鼻鳞状细胞癌[16]等多种肿瘤细胞中呈低表达，但是miR-143-3p在NSCLC的作用机制尚不清楚，本研究结果发现miR-143-3p在NSCLC呈低表达，miR-143-3p低表达与低分化程度、TNM分期、淋巴结转移均有关，说明miR-143-3p表达缺失可能与NSCLC癌细胞恶性增殖、侵袭和淋巴结转移有关。YANG等[17]人报道显示miR-143-3p通过负向调控核糖核酸还原酶M2亚基（ribonucleotide reductase M2 subunit，RRM2）抑制NSCLC癌细胞生长，而这一调控机制受LINC00667调控，提示miR-143-3p通过LINC00667/miR-143-3p/RRM2信号通路参与NSCLC发生和进展。本研究生存分析曲线图显示低miR-143-3p表达NSCLC患者PFS，OS生存率偏低，经COX回归分析miR-143-3p低表达与NSCLC患者随访期间终点事件的发生密切相关，说明miR-143-3p的表达缺失是NSCLC患者肿瘤复发、远处转移、死亡的主要因素之一，这与miR-143-3p表达缺失导致对癌细胞增殖、侵袭抑制作用减弱、致癌基因表达增强有关。

综上，NSCLC患者血浆中miR-520f，miR-143-3p表达均下调，miR-520f，miR-143-3p表达缺失是NSCLC增殖、侵袭、转移的潜在因素，与患者低生存率密切相关。miR-520f，miR-143-3p可以为NSCLC预后评估、临床治疗、病情评估提供一定信息。