基于阻断蛋白质相互作用的抗肿瘤多肽研究进展*

覃韦宁，谷春明，杨方红，张河燕，杨恩泽，武福云，柯镜

（湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000）

恶性肿瘤是临床上常见的导致患者死亡的原因，目前癌症治疗包括手术、化疗、放疗、生物、激素治疗等。然而，这些治疗主要存在的问题是其昂贵的成本和副作用[1]。抗肿瘤肽因其具有多种优势而得到了广泛开发和应用。目前，从植物、动物及微生物中分离出了多种抗肿瘤活性肽，如罂粟花粉中分离的十三肽能够抑制肝癌及乳腺癌细胞的增殖。茜草科植物寒丁子中分离的多肽RAVⅡ具有抗肿瘤活性，在日本作为抗癌药已经进入临床I期[2-3]。许多动物来源的多肽也具有很好的抗肿瘤活性，特别是海洋动物。如海绵和海鞘等的次生代谢产物，因其含有一些特殊的氨基酸，具有抗肿瘤活性[4]。除了天然的活性多肽，利用噬菌体展示技术及化学合成的多种多肽都被报道具有抗肿瘤作用[5]。多肽药物具有多种优势，如免疫原性低、受体结合率高、制备成本低且易于改造和联合应用等，同时抗肿瘤肽又能通过多种机制发挥作用，如抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞坏死、抑制微管合成等[6-8]。目前，一种新的多肽药物研发策略是阻断蛋白质相互作用。因为大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。蛋白质相互作用几乎在整个细胞生命活动过程中发挥功能，如DNA合成、蛋白质翻译、信号转导过程等，蛋白质相互作用构成了细胞生命活动及信号转导的分子网络。蛋白质相互作用异常导致基因表达异常、蛋白质功能异常及信号转导异常，是多种疾病的发病基础。因此，蛋白质相互作用已成为多种疾病治疗的潜在靶点[9-10]。在肿瘤发生发展中，有很多经典的蛋白质相互作用发挥了重要作用，基于阻断这些蛋白质相互作用的抗肿瘤多肽已经取得了极大的研究进展。

表1 抗肿瘤药物的特性比较

1 阻断P53-MDM2相互作用抗肿瘤肽

P53是一个重要的抑癌基因，参与多种细胞生命活动，如基因转录、DNA损伤修复、细胞衰老及凋亡等。大约50%的肿瘤中，P53基因发生了突变或缺失，从而失去了对细胞生长、凋亡及DNA修复的调控[11]。泛素化E3连接酶MDM2是P53最主要的负调控因子，通过N端与P53相互作用，使P53泛素化降解。目前，抑制P53-MDM2相互作用的一些小分子抑制剂，如Nutlins、MI-219，通过靶向MDM2 N端的P53结合位点，维持P53的稳定并激活P53信号通路，发挥了较好的抗肿瘤作用[12]。除此之外，基于阻断P53-MDM2相互作用的抗肿瘤肽也得到了开发。PAZGIER等[13]利用噬菌体展示技术筛选到溶解度高且特异性强的抑制P53-MDM2相互作用的多肽PMI（TSFAEYWNLLSP）。LIU等[14]利用镜像噬菌体展示技术（Mirror imagephage display）筛选出与MDM2分子镜像对映体相互作用的Lpeptide配体，之后通过固相合成等手段合成出与筛选出来的L-peptide配体镜像对应的D-peptide配体、DPMI-γ（DWWPLAFEALLR），D-peptide对目标分子的亲和力与其对应筛选出的L-peptide与目标分子的亲和力相同，但可以抵抗蛋白酶降解。这些多肽都能够阻断P53-MDM2相互作用，促进P53依赖的细胞死亡途径有效激活，发挥抗肿瘤作用。

2 抗肿瘤肽靶向EGF，阻断EGF-EGFR相互作用

表皮生长因子受体（EGFR或Her1/ErbB1）是ErbB细胞膜受体家族的4个成员之一，EGFR广泛分布于哺乳动物细胞表面，通过其细胞外结构域结合配体发生构象变化，导致同型或异型寡聚化而被激活，从而参与细胞的增殖和分化[15]。表皮生长因子EGF是一种包含53个氨基酸的小肽，是EGFR的配体，通过与EGFR的特异性结合，并通过促进EGFR的二聚化和自磷酸化来启动一系列信号级联反应促进细胞增殖，如MAPK、Akt、JNK信号通路等。相关报道表明已在多种肿瘤中发现EGF和EGFR的异常表达及EGFR的突变，导致EGFR信号途径过度激活。EGFR与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等密切相关，是肿瘤化疗的重要靶点[16-17]。目前，针对EGFR的药物有西妥昔单抗和帕尼单抗，通过与EGFR胞外结构域结合从而阻断EGFR激活；以及小分子药物吉非替尼和厄洛替尼，通过阻断EGFR的自磷酸化从而阻断下游的致癌途径[18]。但是这些针对EGFR的药物最大的问题是其副作用和产生的耐药性。GUARDIOLA等[19]利用分子对接技术和EGFR受体热点模拟技术设计并合成了一条EGF结合肽cp28（CQGTSNKLTQLGTFE DHFLSLQRMEFNNC），该多肽能够与EGF结合从而阻断EGFR与EGF的相互作用，并抑制乳腺癌细胞的增殖。这一研究为小分子蛋白的药物多肽开发提供了基础。

3 阻断PD-1/PD-L1相互作用的肿瘤免疫治疗肽

肿瘤免疫治疗是一种新的肿瘤治疗方法。目前，主要是通过抑制免疫检查点来治疗，其中较为有代表性的就是CTLA-4拮抗剂和PD-1/PD-L1抑制剂。CTLA-4是首个被发现的“免疫检查点”，而PD-1/PD-L1被认为是目前肿瘤免疫治疗最有希望的重要靶点。程序性细胞死亡受体1（PD-1）是一种在免疫细胞上表达的重要的免疫抑制分子，通过向下调节免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。PD-L1是PD-1的配体之一，在多种肿瘤细胞中过表达。PD-L1与PD-1的结合导致T细胞免疫抑制的激活，并诱导T细胞凋亡，使肿瘤细胞开启免疫逃逸[20-21]。目前，靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的药物通过阻断肿瘤细胞和T细胞结合，使T细胞能正常发挥作用，持续识别肿瘤细胞并清除。针对PD-1批准上市的单克隆抗体药有Nivolumab和Pembrolizumab，适用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌等。而PD-L1的单克隆抗体抑制剂Atezolizumab、Durvalumab及Avelumab也已经被批准上市。尽管这些针对免疫抑制检查点的抗体药对部分肿瘤具有一定的疗效，但随后产生的耐药性，及其高成本对免疫治疗这一新兴疗法提出了挑战。LI等[22]通过细菌表面展示技术，筛选到了具有高亲和力且特异性结合PD-L1的多肽TPP-1（SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK），TPP-1多肽能够阻断PD-1/PD-L1相互作用，并使T细胞活化，体外裸鼠致瘤实验表明该多肽具有抗肿瘤效应。LIU等[23]利用噬菌体展示技术结合一种新的生物筛选程序得到了能够特异性结合PD-L1的CLP002肽（WHRSYYTWNLNT），该肽能够特异性地结合PDL1与PD-1相互作用的残基，并阻断PD-1/PD-L1在肿瘤细胞中的相互作用，从而激活T细胞发挥抗癌作用。

4 靶向Bcl2-BH结构域，诱导肿瘤细胞凋亡多肽

Bcl-2是凋亡调节蛋白家族中起关键作用的成员，通过与其他凋亡蛋白相互作用，发挥细胞凋亡主开关的作用。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类。Bcl-2蛋白具有4个BH结构域（BH1-4），这是大多数抗凋亡家族成员所特有的，而促凋亡家族成员仅具有BH1-3结构域（例如Bax和Bak）。另外一些促凋亡蛋白，如Bim则仅具有BH3结构域，充当激活Bax或Bak的前哨，进而通过透化线粒体外膜并释放细胞色素c触发细胞凋亡。Bcl-2通过结合这些促凋亡蛋白的BH3结构域形成异源二聚体，从而抑制细胞凋亡。Bcl-2蛋白在多种肿瘤中被发现表达升高，从而增加了肿瘤细胞的凋亡抗性[24-25]。目前，针对Bcl-2蛋白的癌症治疗药物主要是模拟BH3结构域的小分子药物，如ABT-737、ABT-263（Navitoclax）和ABT-199（Venetoclax），通过竞争性地抑制Bcl-2与促凋亡蛋白BH3结构域的结合，从而诱导肿瘤细胞凋亡[26]。除此之外，来源于促凋亡蛋白Bax、Bad、Bim等的BH3结构域的抗肿瘤多肽得到了大量的开发。除此之外，最新研究还开发了针对Bcl-2的BH4结构域的多肽来诱导肿瘤细胞凋亡。Bcl-2能够通过其BH4结构域与肌醇1，4，5-三磷酸受体（IP3R）结合，抑制细胞内钙离子浓度升高而发挥抗凋亡的作用。LAVIK等[27]合成了阻断Bcl-2与IP3R相互作用的多肽BIRD-2（RKKRRQRRRGGNVYTEIKCNSLLPLAAIVRV），能够诱导多种淋巴瘤细胞的凋亡，而且联合模拟BH3结构域的小分子药物ABT-263和ABT-199，肿瘤细胞凋亡效果更加明显。

5 抑制离子通道活化的抗肿瘤肽

钙库调控的钙通道Orai1与多种肿瘤密切相关，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等。在肿瘤细胞内，Orai1蛋白的表达量明显上调，钙电流升高，钙信号被异常激活，促进肿瘤细胞的侵袭迁移，影响细胞增殖，增加肿瘤血管生成。Orai1钙通道的激活依赖于与内质网跨膜蛋白STIM1的相互作用。钙离子信号与肿瘤细胞的发生发展密切相关，Orai1已经成为治疗肿瘤的新的有效靶点[28]。但是，目前研究使用的Orai1钙通道抑制剂，如2-APB和SKF-96365，并没有特异性，在抑制Orai通道的同时，也会抑制其他一些钙通道。我们课题组合成了与STIM1相互作用区域的Orai3-CT多肽，并偶联了细胞穿透肽TAT，成功将TAT-Orai3CT多肽（YGRKKRRQRRRGGRSLVAHKTDRYKQELEELNRLQ GELQAV）导入乳腺癌细胞内，并阻断了Orai1与STIM1的相互作用，抑制了细胞内的钙内流，而且有效抑制了乳腺癌细胞的增殖[29]。

6 展望

目前，蛋白质相互作用已经成为了重要的抗肿瘤靶点，通过阻断蛋白质相互作用从而抑制相关受体的过度激活、促进免疫细胞活化以及诱导细胞凋亡等，给肿瘤带来了新的治疗策略。很多针对蛋白质相互作用开发的小分子药物取得了较好的疗效，但特异性差及耐药性是其主要问题。另外针对蛋白质相互作用开发的单克隆抗体应用到了临床，但成本太高，其次开发难度大，很多蛋白质相互作用的表面比较大而且相对平坦，并没有很好的抗体结合区域，因此这是单克隆抗体药物开发的局限性，而小分子多肽则具有很大的优势[30]。首先，针对蛋白质相互作用位点合成的多肽已被证明能够有效阻断蛋白质相互作用，发挥抗肿瘤作用；其次，抗肿瘤肽分子量小，易于侵入肿瘤细胞；再次，抗肿瘤肽易于合成，成本低，且免疫原性低，副作用小；最后，抗肿瘤肽靶向性好，而且可以通过纳米药物传输系统进行靶向释放。但小分子多肽的主要缺陷是其不稳定性，易于降解。针对这一问题有两种策略能够提高多肽的构象稳定性。一种是通过环化作用，多肽可形成发卡结构、“订书钉”肽等新的更加稳定的构象，另一种是通过修饰作用，将多肽链中参入D型氨基酸或者β氨基酸分别合成D型多肽和β型多肽，也可将多肽侧链与氮原子相连，形成类肽。这些修饰的多肽能够更加稳定且有效地阻断重要蛋白之间的相互作用，从而发挥更好的抗肿瘤作用[31]。总之，基于阻断蛋白质相互作用的抗肿瘤肽以其独有的优势在肿瘤治疗中具有广阔的前景。