黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响

徐晓菲

（山东省肥城市畜牧兽医事业发展服务中心，山东 肥城 271600）

沙门氏菌属于肠杆菌科，兼性胞内致病性革兰氏阴性菌，是引起急性胃肠炎的主要病原之一。其广泛分布自然界，存在于家禽、家畜、鼠类等多种动物的肠道，是引起各种家禽和哺乳动物的传染病的元凶，也可引起人类感染，且该菌在外界环境中抵抗力较强，是目前世界各国分离率最高的菌型之一，具有重要的公共卫生意义[1]。鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠后，可造成小鼠腹泻、肠道充血等，与人感染鼠伤寒沙门氏菌的临床症状相似，主要表现为发热、厌食、呕吐、腹痛、腹胀、腹泻，腹泻频繁者可迅速出现脱水和酸中毒[2]。抗生素的广泛使用，有效地抑制和杀灭了致病性微生物，但由于抗生素的大量使用和滥用导致耐药性鼠伤寒沙门氏菌的问题越来越严重,并在人类和动物群体中广泛传播。因此，迫切需要寻找一种抗生素的取代品。

中草药在我国作为一种药物使用的历史源远流长，中药中含有复杂有效成分，中药能够降低细菌活力、抑制细菌生长、提高机体免疫调节功能且毒性较低[3]。所以，中药已成为去除细菌耐药性的重要方法之一。目前，在临床应用上，中药对细菌性疾病具有较好的治疗作用[4]。从唇形科植物黄芩的根茎中提取的黄芩苷具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、解热、镇静、免疫调节功能、抗肿瘤等药理作用[5]。因此，本论文通过最小抑菌浓度测定实验、抑菌圈测定实验、细菌生物膜实验等体外试验检测黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响；通过动物感染试验，建立鼠伤寒沙门氏菌感染模型，观察治疗效果。通过本次试验研究，为黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌的临床应用提供了试验依据，具有重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株鼠伤寒沙门氏菌，为临床分离株。

1.1.2 主要试剂黄芩苷，含量98 % 以上，购自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.3 主要溶液和试验器材LB培养基和LB固体培养基、生理盐水、0.1 % 结晶紫染色液、95 % 乙醇。电子称、移液枪、离心管、试管、微量加样器、酒精灯、96孔酶标板、接种环、镊子、一次性手套、恒温摇床、培养皿、注射器针头、吸管、打孔器、涂菌器、高压灭菌器等。

1.1.4 试验动物生长状况良好，体重18～22 g，小白鼠30只，均由兽医预防医学实验室提供。

1.1.5 试验仪器ELX800酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制（1）LB培养基。每升培养基在950 ml去离子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，摇动容器直至溶质溶解，用5 mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至 1 000 ml，115 ℃ 高压下蒸汽灭菌20 min。（2）LB固体培养基。每升培养基在950 ml去离子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂30 g，摇动容器直至溶质溶解，用5 mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1 000 ml，115 ℃高压下蒸汽灭菌20 min。（3）结晶紫的配制。用量筒量取100 ml生理盐水，用电子天平称取0.1 g结晶紫，分别倒入棕色瓶中，摇匀，使其充分溶解。配成0.1 % 结晶紫染色液。

1.2.2 中药储存液的配制在超净工作台上，取出药品，摇晃使其溶解，其浓度为20 mg/ml。

1.2.3 鼠伤寒沙门氏菌的培养用灭菌环，挑取少量沙门氏菌干粉于5 ml LB液体培养基中，在摇床上震荡过夜（37 ℃，180 r/min）。第二天，用灭菌环蘸取少量菌液，在LB固体培养基上划线，纯化菌落。挑取单个菌落至在10 ml LB培养基中培养，37 ℃、240 r/min摇菌12 h直到对数生长期，12 000 r/min离心10 min收集细菌。

1.2.4 最小抑菌浓度的测定用镊子夹取高压灭菌后的离心管5支，规格为4 ml，用移液枪在第1支离心管中加入LB培养基980 µl，剩余4支离心管中各加入800 µl LB培养基；无菌操作，用移液枪吸取中药储存液20 µl加入到第1支离心管中，混合均匀后吸取200 µl培养液加入第2支离心管中，依次倍比稀释至第4支管，混匀后从第4支离心管中吸取200 µl培养液弃去，第5支离心管中不加药物，做空白对照，此时，试管里的药液浓度比依次为400、80、16、3.2µg/ml等；用微量加样器吸取浓度为5×103CFU/ml菌液1 ml，依次加到各支离心管中，混匀后，用移液枪从每支离心管中抽取200 µl混合液至96孔酶标板中，每个样4个重复，最终药液浓度比依次为200、40、8、1.6 µg/ml。将酶标板置于37 ℃恒温摇床中孵育24 h。孵育结束后，用酶标仪在630 nm波长下进行测定[6]。

1.2.5 抑菌圈的测定（1）倒板。将已灭菌的琼脂培养基倒入平板内，每板20 ml左右。（2）涂菌。取200 ml浓度为（或麦氏比浊器0.5）菌液，为使涂布均匀，可用涂菌器涂布。（3）打孔。取直径6 mm的琼脂打孔器在每板上均匀打孔5个，去除孔内琼脂，将加热的固体琼脂待冷却后取少量滴入孔底，以便达到封孔的目的。（4）加入待检药液。每孔加入等体积已稀释好的药液36 µl，以满而不溢为最好，设置DMSO稀释剂对照组。（5）孵育。加满后，在37 ℃温箱孵育18～24 h。（6）测量。用mm尺子量取抑菌圈直径。

1.2.6 细菌生物膜测定（1）制备生物膜。用镊子夹取高压灭菌后的离心管5支，规格为4 ml，用移液枪在第1支离心管中加入LB培养基980 µl，剩余4支离心管中各加入800 µl LB培养基；无菌操作，用移液枪吸取中药储存液20 µl加入到第1支离心管中，混合均匀，吸取200 µl培养液加入第2支离心管中，依次倍比稀释至第4支管，混匀后从第4支离心管中吸取200 µl培养液弃去，第5支离心管中不加药物，做空白对照，此时，试管里的药液浓度比依次为400、80、16、3.2 µg/ml等；用微量加样器吸取浓度为5×103CFU/ml菌液1 ml，依次加到各支离心管中，混匀后，用移液枪从每支离心管中抽取200 µl混合液至96孔酶标板中，每个样4个重复，最终药液浓度比依次为200、40、8、1.6 µg/ml。将酶标板置于37 ℃恒温摇床中孵育24 h。（2）结晶紫染色。在恒温培养箱孵育24 h后，取出96孔酶标板，弃去细菌培养液；用微量加样器加入200 µl生理盐水，静置30 s，弃去生理盐水；再加入250 µl 0.1 % 结晶紫染色液，静置1 h；然后孵育1 h，弃去结晶紫染液；再用微量加样器加入200 µl生理盐水，静置30 s，弃去生理盐水；上述步骤重复洗涤两遍；用微量加样器吸取200 µl 95 % 乙醇加入，吹打混合均匀；使用酶标仪在570 nm波长下进行测定。

1.2.7 动物感染试验体重为18～22 g ICR小鼠适应性饲养一周后，随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组、攻毒组和黄芩苷组。第一组腹腔注射生理盐水1 ml作空白对照，剩余两组腹腔注射1 ml浓度为1010CFU/ml·只的鼠伤寒沙门氏菌，同时，黄芩苷组小鼠腹腔注射黄芩苷（1 g/kg）0.2 ml，连续给药7 d，攻毒组和空白对照组腹腔注射生理盐水作对照。攻毒后，连续观察7 d，记录小鼠存活时间。

1.2.8 数据统计分析试验结果数据，通过Excel电子表格进行初步整理后，采用SPSS 22.0统计软件进行分析，数据以“平均值±标准误”来表示。差异显著性用*（表示差异显著P＜0.05）、**（表示差异极显著P＜0.01）、***（表示差异极显著P＜0.001）表示。

2 结果及分析

2.1 黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌生长的结果

通过表1、图1得知，当黄芩苷的浓度在1.6、8、40、200 µg/ml时，对鼠伤寒沙门氏菌的生长无显著影响（P＞0.05）。

表1 不同药物浓度对鼠伤寒沙门氏菌生长的结果

图1 最小抑菌浓度测定

2.2 黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌抑菌圈生成的结果

由表2、图2得知，在孔中分别加入1.6、8、40、200 µg/ml不同浓度的黄芩苷药物，在孔周围均无抑菌圈生成。

图2 不同浓度的黄芪苷药物抑菌圈大小

表2 不用药物浓度对鼠伤寒沙门氏菌抑菌圈大小的影响

2.3 黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌生物膜形成的结果

由表3、图3可知，黄芩苷浓度在1.6 g/ml时，对鼠沙门氏菌生物膜的形成无显著影响（P＞ 0.05）；黄芩苷浓度在8、40、200 g/ml时，能显著（P＜0.05）抑制鼠伤寒沙门氏菌生物膜的形成；当浓度在40 g/ml和200 g/ml时，极显著（P＜ 0.01）抑制鼠伤寒沙门氏菌生物膜的形成。

表3 不用药物浓度对鼠伤寒沙门氏菌生物膜形成的结果

图3 细菌生物膜测定

2.4 黄芩苷对感染鼠伤寒沙门小鼠存活时间的结果

由表4、图4可知，空白对照组小鼠生长状态良好；黄芩苷组在攻毒后第3、4、5、6、7 d，存活率分别为70 %、60 %、60 %、60 % 和60 %，而攻毒组小鼠存活率分别为60 %、40 %、30 %、30 % 和30 %。结果表明，黄芩苷组小鼠的存活率明显（P＜0.05）高于攻毒组。

表4 黄芩苷对感染鼠伤寒沙门小鼠存活时间的结果

图4 黄芩苷对感染鼠伤寒沙门小鼠存活时间的结果

3 讨论

抗生素的大量使用和滥用造成细菌耐药性问题越来越严重，迫切需要寻求一种抗生素的取代品，中药作为一种低毒的抗生素取代品已被广泛使用，为临床用药提供了重要的试验依据，也解决了细菌耐药性等方面问题[7]。本论文通过四个实验研究黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响。

研究黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果，我们采用两种方法进行测定，在最小抑菌浓度测定实验中，用酶标仪检测其结果，在630 nm的波长下测得发现，黄芩苷浓度在1.6、8、40、200 µg/ml时，均对鼠伤寒沙门氏菌的生长无显著影响；说明在此之间的浓度均对鼠伤寒沙门氏菌的生长无抑制效果。在测定黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌抑菌圈生成的实验中，用游标卡尺测量其抑菌圈大小，由图2结果得知，在孔中分别加入1.6、8、40、200 µg/ml不同浓度的黄芩苷药物，在孔周围均无抑菌圈生成。说明黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌无抑制作用。采用以上两种不同方法测定黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果，结果都显示鼠伤寒沙门氏菌对黄芩苷的敏感性较低[8]。

生物膜是细菌在不利其生长的环境下，通过自身产生的细胞外多糖被膜多聚物相互粘连形成的细菌群落[9]。细菌生物膜的形成增加了细菌对不利条件的抵抗力，是细菌持续感染和反复感染的重要原因[10]。目前认为99 % 的细菌以生物膜的形式存在，在人类感染疾病中，有65 % 涉及细菌生物膜。细菌生物膜具有较强的抗药性、病情长期性、可逃避宿主的细胞免疫和体液免疫导致局部炎症反应等作用[11]。因此，细菌生物膜的研究对临床疾病的治疗具有十分重要的意义。本实验通过结晶紫染色使粘附于平板壁的生物膜着色，洗涤后，在570 nm波长下，用酶标仪检测其结果。药物浓度越大，细菌生物膜数量越少，吸光度越低[12]。通过图3的结果可知，黄芩苷浓度在1.6 µg/ml时，对鼠沙门氏菌生物膜的形成不显著；黄芩苷浓度在8、40、200 µg/ml时，能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌生物膜的形成；当浓度在40、200 µg/ml时，抑制效果最好。说明当黄芩苷浓度＞40 µg/ml时，对鼠伤寒沙门氏菌生物膜的形成能达到较好抑制作用。

通过体外试验研究黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响之后，为进一步研究黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗效果，笔者通过体内试验，建立鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠模型，观察小鼠的存活时间[13]。由图4可知，空白对照组小鼠生长状态良好；鼠伤寒沙门氏菌攻毒后，造成小鼠的大量死亡；连续给药7 d后，小鼠的存活率明显提高，且从第4天开始黄芩苷组小鼠的存活率明显高于攻毒对照组，说明黄芩苷药液能抑制鼠伤寒沙门氏菌的侵染，对小鼠起到了保护作用，提高了小鼠的抗感染能力，延长其存活时间，这对鼠伤寒沙门氏菌的临床治疗和药物的合理选用提供了重要的试验依据，也为防治人类感染鼠伤寒沙门氏菌及避免由鼠伤寒沙门氏菌引起的食品安全风险提供了重要的实际性意义[14]。

综上所述，黄芩苷不能抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，但可以抑制细菌生物膜的形成，降低其活性，同时，增强感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠的抗感染能力，延长其存活时间。在临床应用过程中，可以将黄芩苷与氯霉素、喹诺酮类等药物配伍使用以防治鼠伤寒沙门氏菌的感染[15]。

4 结论

本研究通过最小抑菌浓度测定实验，抑菌圈测定实验，细菌生物膜测定实验和动物感染性试验研究了黄芩苷对鼠伤寒沙门氏菌活性的影响和鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗效果，得到以下结论：（1）黄芩苷可以抑制鼠伤寒沙门氏菌的活性。（2）黄芩苷可以应用于防治鼠伤寒沙门氏菌疾病。