锦鲤源钩吻黄杆菌的分离与鉴定

王灿良，郑育昆，李甲维，朱晨浩，任显锋，韦良震，王雪鹏*

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.山东省泰安市水产研究所，山东 泰安； 3.曲阜渔丰现代农业发展有限公司，山东 曲阜）

锦鲤（Cyprinus carpiohaematopterus）在生物学上属于鲤科（Cyprinidae）鲤属，鲤鱼种，锦鲤亚种，全世界共有鲤科鱼类210属3 700种以上。近年来我国的鲤年均产量维持在296万t左右，各养殖场的养殖面积从几亩到数十亩和数百亩甚至千亩不等，其养殖产业形成了巨大的社会效益和经济效益（蒋昕彧，2021；霍凤敏，2010）。

细菌病是锦鲤养殖中的常见病之一，对锦鲤产业造成了较大的危害与经济损失（温周瑞，2020）。其中，黄杆菌（Flavobacterium oncorhynchi），属黄杆菌科（Flavobacteriaceae）黄杆菌 属（李思泉, 2019）。黄杆菌属被Bergey提议（Bergey et al, 1923），并于 1996被定义（Bernardet et al, 1996）。黄杆菌是一种革兰氏阴性菌，其最适温度为25～30 ℃，能够引发多种经济鱼类烂鳃、体表溃疡、出血并导致死亡，有鳃丝发白、不整齐，腹腔有积水，体表溃烂出血等症状（赵占春，1984；柴静茹，2021）。

2020年山东某养殖场出现锦鲤患病现象，为明确病因，本试验从患病锦鲤内脏处分离到1株优势菌CH02，并对该菌进行了理化特性、分类地位、致病性和耐药性研究，以期为该病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

患病锦鲤采自山东某养殖场，体重100～ 200 g，患病锦鲤体表鳞片脱落，游动缓慢，尾柄部皮肤溃烂；剖检可见肝脏有出血点，脾脏、肾脏肿大，伴有腹水。健康锦鲤购自山东济宁某养殖场，体重100～200 g，精神状态良好，在鱼缸中静养3 d后，无异常状况。

黄杆菌培养基为常规Shieh培养基，选择培养基添加托普霉素2 µg/ml、多粘菌素B20 U/ml。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离、纯化、染色特性无菌条件下从患病锦鲤内脏处使用接种环取样，划线接种于Shieh培养基上，30 ℃ 静置培养24～48 h，选择单独的菌落进一步纯化3次。肉眼观察菌落形态、大小、颜色、隆起度等，并进行革兰氏染色观察（柴静茹，2021）。

1.2.2 药敏试验按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）发布的抗菌药物敏感性实验标准进行（张玉蕾，2016）。药敏片种类共14种，包括复方新诺明、多粘菌素B、恩诺沙星、氟苯尼考、克林霉素、大观霉素、多西环素、头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林、氨曲南、丁胺卡那、卡那霉素、米诺环素。

1.2.3 分子鉴定参照Liu等的方法对所分离的菌株进行分子鉴定（Liu Jet al，2012）。采用常规方法提取细菌基因组DNA。PCR上游引物序列5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，下游引物序列5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；反应程序为：预变性95 5min℃ ；变性95 30℃ sec、退火52 40℃ sec、延伸72 1min℃ ，30个循环； 72 ℃ 5min。 PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 系统发育树分析将CH02菌株16SrDNA测序得到的部分基因序列在NCBI网站进行BLA ST，并利用Megalign软件构建系统发育树。

1.2.5 质谱分析取上述分离、纯化的优势菌标记好，涂布于色谱柱上，而后滴加2 µl甲酸，2 µl基质溶液，在超净台内自然风干后，扫描色谱柱条码录入信息后打开软件进行质谱测定。

1.2.6 回归试验利用MS222麻醉试验鱼，后按照0.5 ml/尾的剂量进行腹腔注射，菌液浓度为1.7×108CFU/ml，阴性对照组按每尾0.5 ml注射PBS缓冲液。注射后连续10 d记录其临床症状和死亡情况。取濒死的病鱼内脏器官进行细菌再分离和鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离纯化及革兰氏染色结果

30 ℃ 下，经24 h培养，Shieh培养基上出现了表面上沿着线蔓延生长的黄色菌落。CH02株在Shieh培养基上呈黄色菌落、边缘不整齐、中央较厚、呈颗粒状，如图1。经革兰氏染色后观察，可见菌体呈直杆状或弯曲杆状、呈红色，如图2。

图1 患病鱼细菌分离纯化结果

图2 细菌革兰氏染色图（100倍）

2.2 细菌鉴定

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，如图3。PCR产物序列BLAST比对，与NR117031.1和FR 870076.1、DQ778317.1的同源性分别为99.86 %、99.86 %、99.78 %。质谱结果显示为黄杆菌。使用Megalign构建系统发育树，如图4。

图3 16S rDNA 基因PCR扩增产物

图4 分离菌株系统发育树

2.3 药敏试验

根据药敏纸片说明推荐的抑菌范围（20 mm以上为极敏，15～20 mm为高敏感性，10～14 mm为中敏感性，10 mm以下为低敏感性，0为不敏）判断，克林霉素、复方新诺明、恩诺沙星和大观霉素在本次药敏试验中展现了极好的抗菌效果；多西环素、头孢噻肟、丁胺卡那和米诺环素亦有较好的疗效；对氨苄西林和氨曲南类基本没效果。结果如表1所示。

表1 CH02菌株对14种药敏片敏感程度结果

2.4 回归感染及LD50测定

注射CH02菌株后，逐渐出现烂鳃和死亡情况。注射后死亡或濒临死亡试验鱼的鳃部症状，如图5。

图5 注射后死亡试验鱼鳃部症状

3 讨论

本研究对患病锦鲤进行细菌分离后，发现所分离菌株的优势菌落较为明显，推测可能是细菌感染造成的。进一步对该优势菌株进行革兰氏染色、生化鉴定和分子鉴定等，推测此次锦鲤患病的病原体为钩吻黄杆菌（Flavobacterium oncorhynchi）。黄杆菌广泛存在于水环境中，是多种鱼类的主要致病菌，也可以感染大鲵等多种动物，但大鲵分离株对复方新诺明、头孢唑啉为不敏感（王昕曦，2016），而本试验中分离的菌株对克林霉素、复方新诺明、恩诺沙星和大观霉素非常敏感，对多西环素、头孢噻肟、丁胺卡那和米诺环素较敏感，对氨苄西林和氨曲南类不敏感。这可能是柱状黄杆菌和钩吻黄杆菌的菌体差异造成的。根据药敏试验结果和农业部国家兽医局推荐的水产动物药物使用指南，建议用恩诺沙星治疗钩吻黄杆菌引起的细菌病。

锦鲤养殖不同于畜牧业的养殖，因为锦鲤主要在水下活动，在直观性上会受到极大的限制，因此锦鲤疾病应以预防为主、治疗为辅，防患于未然，才能够保证养殖的综合效益（唐伟林,2021）。此外，锦鲤养殖者还应当学习先进的水质调控技术，先进的管理模式和病害防控技术，以保证锦鲤养殖利益的最大化。本研究发现的黄杆菌高敏抗生素为锦鲤烂鳃病的治疗具有一定的指导意义。