树莓配制酒的色泽稳定性及抗氧化性研究

邢 爽， 梁启茹， 方颂平， 吴文睿，董书甲， 刘 露， 万春环， 蒲顺昌*

(1. 亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800； 2. 亳州学院 配制酒工程技术研究中心，安徽 亳州 236800)

以树莓为原料,以食用酒精为酒基研制的树莓养生配制酒,是一款色泽诱人、口感清爽的酒类饮品。研究表明构成果酒色泽的主要物质是来源于果实并在酿造过程中发生复杂衍化反应的花青素及其衍生物[1-2],树莓配制酒的色泽则主要由于树莓浆果中花青素溶出导致,但花青素不稳定,对酒的色泽稳定性影响较大,自然状态下,花青素常与各种单糖形成糖苷,以花色苷的形式存在。在溶液体系中,花色苷存在着4种平衡结构:黄烊阳离子(红色)、醌式碱(蓝色)、查尔酮和甲醇式假碱(无色),这4种结构随着溶液 pH等条件的变化而相互转化,从而使溶液呈现出不同的颜色[3-4],同时色泽的稳定性容易受到温度、氧气、pH等因素的影响,导致带有色泽的酒在销售过程中颜色不容易保持,且色泽的不稳定会极大限制花色苷等物质的营养价值[5-7],影响酒的保值性,因此研究酒的色泽稳定条件及护色工艺对酒的保值具有重要意义。

树莓配制酒中含有大量的多酚类物质,这些物质具有强抗氧化性,当向酒中加入氧化物质自由基时,酒中具有强抗氧化性的物质发挥作用,通过测自由基的清除率,可以得到树莓配制酒的抗氧化性能力,据有关研究,抗氧化性与物质抗肿瘤、抗炎、抗衰老等其他功效密切相关[8-9],因此研究树莓配制酒的抗氧化性可为后续深入研究酒的其他功效机理提供理论依据。

本研究通过pH示差法研究了温度、光照、氧气以及有机酸对树莓配制酒色泽稳定性的影响,树莓配制酒中含有丰富的抗氧化性物质,通过测定其对DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基的清除能力对其抗氧化性进行了研究,进行树莓配制酒的稳定性研究进而确定其储存条件,有助于产品的销售,研究其抗氧化性有助于明确产品的营养价值,为后续对树莓配制酒营养价值的深入开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室自主研制的树莓配制酒;氯化钾、醋酸钠、乙酸(分析纯,天津市津东天正精细化学试剂厂);七水合硫酸亚铁、水杨酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);苹果酸、DPPH、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸(分析纯,博美生物科技有限责任公司);邻苯三酚(分析纯,倍缘化工有限责任公司)。

1.2 仪器与设备

HH.S21-8-S型数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司);FiveEasy Plus型pH计(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司);ME204E型电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司);SPX-400-III型生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);UV-9000S型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 树莓配制酒的色泽稳定性研究

1.3.1.1 温度对树莓配制酒色泽稳定性的影响 分别取100 mL澄清的树莓配制酒于5组锥形瓶中,分别置于-10、10、20、40、50、60 ℃的恒温生化培养箱中,每天取样1次,用pH示差法测定酒样在最大吸收波长513 nm处的吸光度,利用矢车菊素葡萄糖苷的经验公式计算花青素的含量[10],研究温度对树莓配制酒色泽稳定性的影响。

1.3.1.2 光照对树莓配制酒色泽稳定性的影响 分别取100 mL的树莓配制酒于4组锥形瓶中,并分别放置于紫外灯、白炽灯、自然光以及避光条件下;为了避免因紫外灯和白炽灯辐照产热而引起花青素降解[9],酒样放置于20 ℃恒温生化培养箱中。每2 h取样一次,用pH示差法测在最大吸收波长处的吸光度,利用矢车菊素葡萄糖苷的经验公式计算花色苷的含量,研究光照对树莓配制酒色泽稳定性的影响。

1.3.1.3 氧气对树莓配制酒色泽稳定性的影响 分别取100 mL树莓配制酒于4组锥形瓶中,一组敞口保存,其中两组分别用纱布、脱脂棉覆盖锥形瓶口,一组用封口膜密封瓶口(利用样品的封口形式近似表示样品贮存的氧浓度状态),将4组锥形瓶均置于20 ℃的恒温培养箱中,每天取样一次,利用矢车菊素葡萄糖苷的经验公式计算花色苷的含量,研究氧气对树莓配制酒色泽稳定性的影响。

1.3.1.4 有机酸对树莓配制酒色泽稳定性的影响 取100 mL树莓配制酒于锥形瓶中,分别添加 0、0.5、1.0、1.5(g/L)的苹果酸、柠檬酸和乙酸的单一酸溶液,置于20 ℃恒温培养箱中密封保存,每天取样一次,用pH示差法测酒样在最佳吸收波长处的吸光度,利用矢车菊素葡萄糖苷的经验公式计算花色苷的含量,研究有机酸对树莓配制酒色泽稳定性的影响。

1.3.2 树莓配制酒的抗氧化性研究

1.3.2.1 树莓配制酒对DPPH自由基清除能力的测定方法 精确称取19.7 mg的DPPH,用无水乙醇定容至250 mL,充分混匀。将树莓配制酒配制成不同梯度浓度的待测样品溶液,并将样品溶液与DPPH溶液按1∶1混合,避光反应30 min,517 nm下测定吸光度[11-14],并做空白对照,同时以100 mg/L的抗坏血酸进行比较研究,分别计算树莓配制酒和抗坏血酸对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率计算公式为:DPPH自由基清除率(%)=[(Ao-Ax)/Ao]×100%,式中:Ao为空白对照的吸光度;Ax为样品的吸光度。

1.3.2.2 树莓配制酒对羟基自由基清除能力的测定方法 分别取1 mL不同浓度的树莓配制酒,加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液 1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液 1 mL,经37 ℃水浴反应0.5 h后,于510 nm下测定吸光度,并做空白对照。同时以100 mg/L的抗坏血酸进行比较研究,分别计算树莓配制酒和抗坏血酸对羟基自由基的清除率。

羟基清除率计算公式为:羟基清除率(%)=[1-(Ax-Axo)/Ao]×100,式中:Ao为空白对照不加待测溶液的吸光度;Ax为加入待测溶液后的吸光度:Axo为不加H2O2待测溶液的吸光度。

1.3.2.3 树莓配制酒对超氧阴离子自由基清除能力的测定方法 取Tris-HCl缓冲液4.5 mL(50 mmol/L,pH 8.2)于试管中,加入2.0 mL蒸馏水后充分混匀,37 ℃水浴30 min,加入2.0 mL不同浓度的树莓配制酒和0.5 mL邻苯三酚溶液(25 mmol/L,37 ℃预热),混匀后37 ℃水浴6 min,滴加1 mL盐酸(10 mmol/L)终止反应,320 nm下测定吸光度,并做空白对照,同时以100 mg/L的抗坏血酸进行比较研究。分别计算树莓配制酒对超氧阴离子自由基的清除率。

超氧阴离子自由基清除率的计算公式:超氧阴离子自由基清除率(%)=(Ao-Ax)/Ao×100%,式中,Ao为空白对照液的吸光度;Ax为待测溶液的吸光度。

1.4 树莓养生配制酒色泽稳定性的分析方法

采用pH示差法对花青素进行定量分析,以矢车菊素葡萄糖苷的经验公式来计算样品酒中的花青素含量,研究树莓养生配制酒的色泽稳定性,但样品酒中花青素成分比较复杂,虽然经验公式是基于矢车菊素葡萄糖苷,但最佳测定波长应根据具体样本进行优化[15-16]。花青素含量计算公式如下:

式中:C为树莓配制酒中花青素含量,mg/L;A=A(513 nm,pH1.0)-A(513 nm,pH4.5);M为矢车菊素葡萄糖苷的相对分子质量,449.2 g/mol,n为样品稀释倍数;n为矢车菊素葡萄糖苷的摩尔消光系数,26 900 (L/mol)·cm-1。

1.4.1 吸收波长的确定 将树莓配制酒用pH 1.0的KCl缓冲液稀释40倍,用紫外可见分光光度计扫描树莓配制酒在300～700 nm处的吸收光谱图。同理,将树莓养生配制酒用pH 4.5的醋酸钠缓冲液稀释40倍,扫描其在300～700 nm范围内的吸收光谱图。当吸光度出现最大差值时,此时的波长为实验的最佳波长[17]。

1.4.2 平衡时间和平衡温度的确定 在高温条件下,花色苷易分解,不同样品在不同温度下达到平衡的时间也不同,因此需要确定树莓配制酒在 pH 1.0和 pH 4.5缓冲溶液中的平衡时间和平衡温度。将稀释40倍的树莓养生配制酒分别置于20、30、40、50和 60 ℃的恒温水浴锅中,每 10 min取样一次测其吸光度,当吸光度稳定时,实验结束并记录结果,得到最短的平衡时间和最适宜的平衡温度[17]。

1.5 数据处理

每组实验均进行3次平行实验,实验数据的处理以及显著性分析使用SPSS统计分析软件,图表使用origin 8.5绘制。

2 结果与分析

2.1 pH示差法吸收波长以及平衡时间、平衡温度的确定

经测定,树莓配制酒样品在pH 1.0和pH 4.5的缓冲液中,吸收波长在513 nm处出现最大差值,因此,使用513 nm作为检测树莓配制酒的最佳波长。同时，样品在pH 4.5和pH 1.0的缓冲液中,30 ℃水浴90 min吸光度趋于稳定。因此,树莓配制酒的平衡温度选择30 ℃、平衡时间选择90 min。

2.2 树莓配制酒的色泽稳定性研究

2.2.1 温度对树莓配制酒色泽稳定性的影响 树莓配制酒经过不同的温度处理后,花青素含量变化如图1所示。由图1可以看出,在-10 ℃的低温环境中,花青素含量变化不大,表明在低温条件下花青素以稳定的结构存在于树莓配制酒中或酒中与大分子结合的花色苷释放;而随着温度的升高和处理时间的延长,花青素稳定性降低,尤其是高温环境下随着贮存时间的延长,酒中花青素含量显著降低(P<0.05)。20 ℃贮存5 d花青素的保留率为91.37%;而在高温环境中花青素大量降解,50 ℃时,花青素保存率仅有22.95%。由此表明,高温对花青素破坏极大,低温对树莓配制酒中的花青素有保护作用,树莓配制酒应在低温环境中储存,以确保其色泽稳定性。王子悦[18]分别研究了贮藏温度对红苋菜花青素稳定性的影响,研究表明红苋菜花青素在低温下有较高的稳定性,研究结果与本文结果类似。

图1 温度对树莓配制酒色泽稳定性的影响

2.2.2 光照对树莓配制酒色泽稳定性的影响 如图2所示,与温度相比,光照对树莓配制酒中花青素的影响较小。避光保存第1天酒中花青素的含量有所上升,而随着储存时间的延长,花青素含量逐渐下降,12 h之后,花青素含量为133.67 mg/L,保存率最高。在紫外灯照射下的树莓配制酒中花青素含量下降缓慢,12 h之后,花青素含量为132.89 mg/L,保存率为98.33%;而自然光下的酒样12 h之后,花青素含量为132.67 mg/L,保存率为98.17%,这与焦娇等[19]研究紫外光照对红枣发酵酒色泽稳定性影响结果类似。而白炽灯对花青素的稳定性破坏性较强,12 h之后,花青素含量为127.67 mg/L,保存率为93.73%。由此表明,白炽灯对花青素的稳定性破坏性较强,不利于树莓配制酒的色泽稳定;紫外光线波长较短,对树莓配制酒中色泽稳定性并无影响;而在避光条件下,12 h之后花青素含量最高,表明避光保存有利于树莓配制酒的色泽稳定性[20]。

图2 光照对树莓配制酒色泽稳定性的影响

2.2.3 氧浓度对树莓配制酒色泽稳定性的影响 在不同的氧浓度环境中,树莓配制酒中花青素的稳定性不同。由图3可以看出,在敞口和纱布覆盖的条件下,树莓配制酒中花青素含量下降速度较快(P<0.05),表明在与氧气接触的环境中,酒样中的花青素大量分解,不利于树莓配制酒的色泽稳定;而在脱脂棉及封口的微氧环境中,树莓配制酒中的花青素含量呈现先上升后下降的变化趋势,最终花青素含量为107.8 mg/L,表明在微氧环境中,酒中与大分子结合的花青素先释放,之后由于氧气的影响,花青素分解;而在封口膜密封的无氧环境中,花青素含量也有所下降,但下降速度缓慢,最终花青素含量为108.5 mg/L。由图可知,5 d后花青素含量的关系是:密封>脱脂棉>纱布>敞口。由此可知,氧气使树莓配制酒中的花青素大量分解,对树莓配制酒的色泽稳定性有不利的影响,树莓配制酒应密封储存。

图3 氧浓度对树莓配制酒色泽稳定性的影响

2.2.4 有机酸对树莓配制酒色泽稳定性的影响 向树莓配制酒中添加不同浓度的苹果酸、柠檬酸和乙酸后,树莓配制酒中花青素含量变化分别如图4～6所示。从图中可以看出,向树莓配制酒中添加不同浓度的苹果酸、柠檬酸和乙酸后,树莓配制酒中花青素含量均有所下降,但与对照组相比,添加了苹果酸和柠檬酸的酒样中花青素含量下降速度缓慢,并随着苹果酸和柠檬酸浓度的增加,树莓配制酒的花青素越稳定,当有机酸的添加量为1.5 g/L时,花青素含量较对照组差异显著(P<0.05),可能是因为花青素在酸性环境中稳定性增强[21]。

从图4～5可以看出,在加入不同浓度的苹果酸和柠檬酸条件下,树莓配制酒储藏5 d后的色泽保存率随着有机酸浓度的升高而增大,以添加1.5 g/L的柠檬酸效果最显著,花青素含量为124.99 mg/L,色泽保存率达到96.87%,稳定性最好。秦丽欢等[22]采用不同浓度柠檬酸作为清洗剂清洗杏干发现柠檬酸在一定程度上可使杏干保持较好的外观色泽,周剑忠等[23]研究发现苹果酸提高蓝莓汁色泽稳定性的效果显著优于其它有机酸。以上研究说明柠檬酸与苹果酸均在一定程度上有助于色泽稳定,与本研究结果类似。

图4 苹果酸对树莓配制酒色泽稳定性的影响

图5 柠檬酸对树莓配制酒色泽稳定性的影响

从图6可以看出,在添加了不同浓度乙酸的树莓配制酒中,花青素含量先大幅下降且酒体有浑浊现象,之后花青素含量缓慢上升,可能因为乙酸酸度过高,使酒中与大分子物质结合的花青素大量释放,形成沉淀;之后由于花青素水溶性较强,沉淀溶解,花青素含量又缓慢上升,目前研究乙酸对食品色泽稳定性的研究不多。因此,在树莓配制酒中添加适量的苹果酸和柠檬酸可以使花青素以稳定的结构存在于树莓配制酒中,有助于保护其色泽稳定性,而乙酸可能导致酒中与大分子物质结合的花青素大量释放,形成沉淀,不利于树莓配制酒的稳定性。

图6 乙酸对树莓配制酒的影响

2.3 树莓配制酒的抗氧化性研究

2.3.1 树莓配制酒对DPPH自由基清除能力的研究 DPPH是一种稳定存在于有机溶剂中的自由基,在乙醇溶液中呈深紫色,于517 nm的波长处有最大吸光度,其吸光度与浓度成正比,当加入自由基清除剂或抗氧化剂时,它们会结合或取代自由基,DPPH数量变少,其吸光度也会变小[24]。

如图7所示,树莓配制酒和抗坏血酸对DPPH自由基清除率均随着稀释倍数的增加迅速降低,即与浓度呈现线性相关。在同一稀释倍数下,树莓配制酒对DPPH自由基清除率高于抗坏血酸,其中树莓配制酒的DPPH自由基清除率94.67%,远高于100 mg/L抗坏血酸DPPH自由基清除率,表明树莓配制酒具有较好的DPPH自由基清除能力,对人体具有一定的抗氧化性作用。

图7 树莓配制酒对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 树莓配制酒对羟基自由基清除能力的研究 羟基自由基与人体细胞的衰老、突变密切相关,是对人体危害最大的一种自由基[25]。如图8所示,树莓配制酒和抗坏血酸对羟基自由基的清除率与浓度呈线性相关,随着稀释倍数的增加迅速降低,在同一稀释倍数下,树莓配制酒的羟基自由基清除率高于抗坏血酸,其中树莓配制酒的羟基自由基清除率为91.67%,远高于100 mg/L抗坏血酸的羟基自由基清除率,表明树莓配制酒具有很好的羟基自由基清除能力,在一定程度上具有一定的营养价值。

图8 树莓配制酒对羟基自由基的清除能力

2.3.3 树莓配制酒对超氧阴离子自由基清除能力的研究 超氧阴离子是人体代谢过程中产生的可以攻击体内生物大分子、引起细胞结构和功能破坏的一种自由基,与人体的衰老病变密切相关[26]。如图9所示,成品树莓配制酒和抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除率与浓度呈线性相关,随着稀释倍数的增加迅速降低,在同一稀释倍数下,树莓配制酒对超氧阴离子自由基清除率高于抗坏血酸,其中树莓配制酒的超氧阴离子自由基清除率77.5%,远高于100 mg/L抗坏血酸的超氧阴离子自由基清除率,表明树莓配制酒同样具有很好的超氧阴离子自由基清除能力。

图9 树莓配制酒对超氧阴离子自由基的清除能力

3 结论与讨论

根据树莓配制酒的色泽稳定性分析,20 ℃以下的低温、避光、密封保存可以使花青素以稳定的结构存在于树莓配制酒中,有利于树莓配制酒的色泽稳定。由于树莓配制酒的呈色物质主要是花青素,花青素在酸性条件下能保持稳定状态,在不影响口感的情况下向树莓配制酒中加入适量的苹果酸和柠檬酸,有利于提高树莓配制酒的色泽稳定性,而加入乙酸则会使树莓色泽稳定性降低；同时,温度相对于其他条件而言对本酒的色泽稳定性影响最大。总之,为了保证树莓配制酒的色泽稳定,本酒适于在低温、避光、密封条件下储存,在利用有机酸进行勾调时避免使用乙酸。

经过对树莓配制酒的体外抗氧化活性的测定,与100 mg/L的抗坏血酸相比,树莓配制酒具有更高的DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基清除能力,其中DPPH自由基清除率最大为94.67%,羟基自由基的清除率最大为91.67%,超氧阴离子自由基清除率最大为77.5%,表明树莓配制酒具有很好的抗氧化活性,具备能够清除人体内自由基的能力。自由基或氧化剂会将细胞和组织分解,影响代谢功能,并会引起不同的健康问题,随着生活水平的提高,具有抗氧化作用的酒引起人们重视,树莓配制酒的抗氧化性较强、极具营养保健价值,因此具有广阔的发展空间。本研究为后续优化树莓配制酒的护色工艺进而确定其他贮存条件奠定基础,为进一步深入研究树莓配制酒功效提供理论基础。