枳椇山楂果酒酿酒工艺优化及抗氧化活性分析

吴双从，曹新志，张楷正，王 静，宋泽丽，周安琪

（四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000）

枳椇（Hovenia dulcis）俗名拐枣，因不同于其他水果的奇特造型又名“万寿果”[1]。枳椇果梗每100 g含粗脂肪74 mg，粗蛋白质3.07 mg，总酸345.8 mg，维生素C（vitamin C，VC）16.29 mg。鲜果中含有丰富的活性多糖、有机酸、钙、铁、磷、硒、生物碱等有效有益成分，其富含的糖类物质、氨基酸含量相媲美于葡萄，是优质的果酒原料且酿造时间短[2]。酿造的果酒颜色黄绿，营养成分丰富、口感清新香甜、风味俱佳，枳椇鲜果及其深加工产品深受国内外消费者青睐，此外枳椇果梗水提取液具有抗肿瘤，缓解酒精性肝损伤[3]的功效。枳椇果酒作为拓宽枳椇资源利用的重要方式，白小琼[4]以重庆地区的野生枳椇果实为主要原料，结合果酒酿酒技术，优化了枳椇果酒的发酵工艺：白砂糖用量18.0%，酵母用量0.15%，发酵温度为22 ℃，在此条件下枳椇果酒的酒精度、总酸及总糖含量分别是12.0%vol、7.3 g/L、9.7 g/L，向金环[5]利用枳椇果实的野生酵母，对果渣和果汁二次自然发酵，酒放置于溶洞后熟，提高出酒率的同时增加了自然风味；司武阳[6]公开一种枳椇酒精饮料，制备枳椇果汁，添加液体果汁（草莓、苹果、菠萝、香蕉等）制成的比例在1～3∶10的复合果汁，在温度8～11 ℃、5 d的主发酵和3～4 ℃、4 d的后发酵得到的一种低酒精度枳椇饮料，风味佳口感好，表明添加其他水果果汁提高了枳椇果酒的品质。

多酚、有机酸、香气成分的种类和含量是影响果酒品质的重要因素[7]。通过调整原料果汁中多酚、有机酸、香气成分的种类增加或降低其含量可实现改善果酒品质的目的。将不同水果混合是提高果汁或果酒品质常用方法之一，目前在枳椇复合果酒酿造方面研究较少。山楂高酸低糖且富含多种维生素和黄酮类物质，对心血管系统具有显著的保健作用[8]，利用山楂复配发酵的山楂鸭梨[9]、山楂红枣[10]、苹果山楂[11]、山楂山药[12]、山楂龙眼[13]等复合果酒的研发丰富果酒品类的同时，提高了果酒的感官品质与营养价值。枳椇果汁高糖低酸与山楂汁高酸低糖混合后，糖酸比协调，口感酸甜且营养丰富，利用山楂来提高枳椇果酒的综合理化品质，并进行酿造工艺优化，旨在丰富枳椇果酒品类，为枳椇复合果酒提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枳椇果梗：安徽秦岭；山楂：市售；商业酿酒酵母（SP）：安琪股份有限公司；果胶酶（50 000 U/g）：南宁庞博生物技术有限公司；纤维素酶（20 000 U/g）：绵阳禾本生物工程公司；偏重亚硫酸钾、无水柠檬酸（食品级）：山东省新怡酿酒公司；白砂糖：市售。

NaOH、无水乙醇、Na2CO3、NaNO2、没食子酸、芦丁、无水葡萄糖、Al（NO3）3、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂、Folin酚：福州飞净生物科技有限公司。所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PP251美的榨汁搅拌器：广东美的生活电器制造有限公司；WZ103手持糖度计：成都世纪方舟科技有限公司；SGSP-02电热恒温隔水培养箱：武汉天鹰医疗设备有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；UV-1000型紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；wTB-1003电子天平：杭州万特衡器有限公司；PHS-25 pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SW-CJ-1D型单人无菌工作台：上海泸净医疗器械有限公司；酒精计：石家庄百亨通用仪器仪表制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 枳椇山楂果酒酿造工艺流程及操作要点

操作要点：

（1）枳椇果汁的制备：选取完全成熟，果梗饱满且经过预处理的果梗添加1.2倍质量的蒸馏水，打浆在高速组织破碎机中破壁2 min。添加0.40%复合酶（果胶酶∶纤维素酶质量比为5∶7）于45.0 ℃、40 W的超声波环境中酶解2 h，无菌纱布过滤除去粗纤维质得枳椇果汁。

（2）山楂果汁的制备：参照李慧芸等[11，14]的方法并稍作修改，山楂冻结10 h破坏细胞壁促进组织液和营养成分溶出、2.0倍山楂质量比的蒸馏水打浆，添加1.0 mL/kg的果胶酶，酶解温度60 ℃下酶解2.15 h，过滤取汁。

（3）果汁复配：将制备好的枳椇果汁和山楂果汁按照一定的比例混合。

（4）调整糖度、酸度：添加粉碎成粉末状的白砂糖，调整为需要的枳椇果汁糖度，以无水柠檬酸调节复配果汁的酸度至4.0以下。

（5）酵母活化与主发酵：将1.0%的商业酿酒酵母（SP）置于5%糖度无菌水，在30 ℃活化30 min。无菌环境下接种于500 mL的三角瓶，装液量300 mL，于28 ℃条件下恒温发酵7 d。

（6）倒罐后发酵：虹吸倒罐，上清液于低温条件下后发酵15 d，即得枳椇山楂果酒。

1.3.2 枳椇山楂果酒酿造工艺优化单因素试验

考察不同山楂汁与枳椇汁体积比（10∶100、20∶100、40∶100、60∶100、80∶100、100∶100）、不同初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%）、酵母接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、发酵温度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）、发酵时间（7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）对枳椇山楂果酒发酵的影响。

1.3.3 枳椇山楂果酒酿造工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，挑选对枳椇山楂果酒发酵影响较大的因素设计正交试验，并确定最佳工艺条件组合。正交试验因素与水平见表1。

表1 枳椇山楂果酒酿造工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Hovenia dulcis and hawthorn wine fermentation process optimization

1.3.4 枳椇山楂果酒质量评价

（1）基本理化指标的测定

总酸含量测定均参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；总酚采用Folin-Ciocalte比色方法测定[15]；酒精度采用重铬酸钾氧化法测定[16]；还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法测定[17]；总黄酮采用硝酸铝比色法测定[18]；可溶性固形物含量采用手持糖度计测定。

（2）枳椇山楂果酒抗氧化活性分析

以0.3%维生素C溶液为阳性对照，测定复合果酒、枳椇果酒的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS+）自由基清除能力和铁离子还原能力，探究其抗氧化活性。

①DPPH自由基清除率测定：参照金海炎等[19]的测定方法，略作改动，准确称取0.019 7 g DPPH溶于250 mL甲醇中得0.2 mmol/L DPPH溶液，吸取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL样液定容至2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液避光反应30 min，于波长517 nm处测定A517/i，同时测定2 mL待测液与2 mL溶剂无水乙醇混合后的吸光度值A517/j，以及2 mL无水乙醇与2 mL DPPH溶液混合后的吸光度值A0。按式（1）计算DPPH自由基清除率。

②ABTS+自由基清除率测定：参照王子涵等[20]的测定方法略作改动，ABTS+自由基储备液：准确量取440 mL浓度140 mmol/L过硫酸钾溶液，加入25 mL浓度7 mmol/L的ABTS+溶液中混合，避光反应12～16 h，避光保存。测定前用无水乙醇将ABTS+自由基储备液稀释到OD734nm值为0.700±0.002，稀释液当天用。

吸取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL样液定容至2 mL，待测液混匀，吸取2.0 mL ABTS+自由基稀释液，室温下避光反应30 min，以无水乙醇为参比，于波长734 nm处测定吸光度值A1。以0.3 mL无水乙醇代替待测液作空白对照，测定吸光度值A0。VC作为阳性对照，ABTS+清除率按式（2）计算。

1.3.5 感官评定

分别选择男女专家共10人，组成品评组，感官评分参考GB/T 15038—2006《葡萄酒与果酒》评分标准，见表2。

表2 枳椇山楂果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

1.3.6 数据分析

使用Excel 2010整合试验数据，每组试验重复3次；使用SPSS 26.0软件进行统计分析，利用方差分析（analysis of variance，ANOVA）与Duncan检验进行差异显著性检验，P＜0.05表示差异显著；使用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 枳椇山楂果酒酿造工艺优化

2.1.1 枳椇果汁与山楂果汁体积比对枳椇山楂果酒发酵效果的影响

单一的枳椇果汁发酵酒，酒体淡薄，香气不足，不同枳椇果汁与山楂果汁体积比对果酒发酵效果的影响见表3。

表3 原料体积比对枳椇山楂酒发酵的影响Table 3 Effect of raw material volume ratio on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

由表3可知，添加外源山楂汁具有增加枳椇汁酸性的作用，直接表现为随着山楂汁体积占比增加，复合汁pH下降；在相同发酵条件下，山楂汁占比增加可溶性固形物、残糖升高，其原因是山楂汁的高酸性，酸度的降低对酵母的发酵能力存在一定的抑制作用[21]，而使得山楂汁体积占比高的混合果酒起发酵时间延后，其可溶性固形物、残糖的变化显著趋势与路遥[22]研究无花果的结果保持一致；在增加山楂汁体积占比大于40∶100之后酒精度降低，残糖升高，酒体甜度高。山楂是一种极具营养价值的物质，含有丰富的黄酮类物质[23]，它的添加使得酒质中总酚、总黄酮含量呈现正相关性增长，但体积比超过60∶100后酒质中总酚增长不显著（P＞0.05），说明其有效成分溶解达到饱和。综合比较分析，枳椇果汁与山楂果汁体积比为40∶100与60∶100时，糖酸比协调，口感醇厚，稍有回味，有效活性成分及感官评分均最高。

2.1.2 不同初始糖含量对枳椇山楂果酒发酵效果的影响

考察不同初始糖含量对果酒的影响，结果见表4。由表4可知，在16%～24%初始糖度区间内，随着初始糖度的增加，果酒酒精度随之增加，符合果酒发酵特点[24]，但由于糖的高渗作用，高糖度又会对酵母菌生长产生抑制作用[21]，表现为初始糖度＞20%时，残糖及可溶性固形物含量增加，使得果酒中的甜度掩盖酒中的酸感、酒感，感官品质下降；总酚含量呈现先增加后减小的趋势，这与杨华等[25]发酵的趋势相同；初始糖度在20%时，果酒清木香明显、果香浓郁，糖酸比合适，回味悠长，表现出的感官评分最高为（72.15±1.25）分、总酚含量最高为（218.30±0.63）mg/100 mL。因而最佳初始糖度为20%。

表4 不同初始糖度对枳椇山楂果酒发酵的影响Table 4 Effect of different initial sugar content on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

2.1.3 不同酵母接种量对枳椇山楂果酒发酵效果的影响

酵母菌接种量影响果酒的发酵速率，发酵前期迅速发展成优势菌株对杂菌具有一定的抑制作用，一般酵母用量过低时，物料发酵不完全，造成发酵液酒精度偏低及酒香不明显等现象，但发酵速率较快，产酸量增加会对果酒后期发酵过程产生影响，加速酵母菌的衰亡，同时酵母菌体自溶会使整个果酒酒体出现苦味[26]。不同酵母接种量对枳椇山楂果酒发酵效果的影响见表5。由表5可知，随着接种量的逐步增大，残糖含量逐渐降低，酒精度在接种量2%时最大，继续增加酵母菌接种量酒精度上升趋势减小，这与李慧芸等[27]的研究一致；接种量对pH影响不显著（P＞0.05）；总黄酮含量在酵母接种量1%与2%时表现为最大且二者差异不显著（P＞0.05）。综上可得，酵母接种量为2%时，总酚、总黄酮、总酸含量最高，所酿果酒酒香舒适，酸甜可口，口感醇厚，香气清爽，其感官评分为（72.05±1.03）分。所以最佳酵母接种量为2%。

表5 不同酵母接种量对枳椇山楂果酒发酵的影响Table 5 Effect of different yeast inoculums on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

2.1.4 不同发酵温度对枳椇山楂果酒发酵效果的影响

不同发酵温度对枳椇山楂果酒发酵效果的影响见表6。由表6可知，随发酵温度升高，酒精度呈现先增高后减小的趋势，残糖与可溶性固形物表现出相反趋势，符合果酒发酵趋势，酒精度增高后下降的趋势的原因是随着发酵温度的增加，酵母生长旺盛，营养物质如糖分主要用于自身生长繁殖，而用于分解产生乙醇的量减少，其变化趋势与顾凡等[28]研究不同温度对葡萄百香果酒结果一致；发酵温度对总酚影响差异性显著（P＜0.05），不同发酵温度对残糖的影响表现为先降低后升高且差异性显著（P＜0.05），在24 ℃的发酵温度下残糖最低。发酵温度20～28 ℃时酒体中总酸含量较高；总黄酮含量随发酵温度升高而逐渐降低，24 ℃、28 ℃、32 ℃之间差异性不显著（P＞0.05）。说明发酵温度对酒体理化性质存在影响，在24 ℃残糖最低[（13.36±0.12）g/L]、总酸含量适中[（10.82±0.03）g/L]、感官评分（73.91±0.51）最优，所以最佳发酵温度为24 ℃。

表6 不同发酵温度对枳椇山楂果酒发酵的影响Table 6 Effects of different fermentation temperature on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

2.1.5 不同发酵时间对枳椇山楂果酒发酵效果的影响

不同发酵时间对枳椇山楂果酒发酵效果的影响见表7。由表7可知，发酵时间对酒体pH的影响不显著（P＞0.05），都维持在4.0左右；可溶性固形物随发酵时间的延长而降低；不同发酵天数的酒精度存在显著性差异（P＜0.05），酒精度总体呈现先增加后降低的趋势；残糖随发酵时间的延长而降低，发酵7 d与其他时间的残糖含量存在差异显著性（P＜0.05），9 d、11 d、13 d差异不显著（P＞0.05），说明发酵在9 d后糖的利用达到最大，酵母菌死亡。总酸变化规律性不强，这可能与微生物代谢特性及生长曲线有关[29]；酚类物质为热敏性物质，所以发酵时间越长酚类物质损失越严重，总酚含量呈现显著性下降。发酵时间9 d时，酒精度较高[（11.45±0.15）%vol]、残糖较低[（14.55±0.25）g/L]，其感官评分（75.50±2.10）最高，所以正交试验选择发酵时间为9 d。

表7 不同发酵时间对枳椇山楂酒发酵的影响Table 7 Effect of different fermentation time on fermentation of Hovenia dulcis fruit wine

2.2 枳椇山楂果酒酿造工艺优化正交试验结果与分析

以果酒的总酸含量、总酚含量及感官评分作为评价指标进行正交试验优化，试验结果与分析见表8。由表8可知，当以总酸含量做评价指标时，对试验结果影响次序为原料体积比＞初始糖度＞发酵时间＞发酵温度，最优的酿造工艺为A3B3C1D2与A3B3C3D2，但由表9可知，总酸方差分析中发酵时间（C）影响差异不显著（P＞0.05），总酸含量为指标的最优工艺选择A3B3C1D2即可；当以总酚含量做评价指标时，影响次序为初始糖度＞原料体积比＞发酵时间＞发酵温度，最优的酿造工艺为A3B3C2D1；当以感官评价做评价指标时，影响次序为原料体积比＞发酵温度＞初始糖度＞发酵时间，最优的酿造工艺为A3B3C3D3。

表8 枳椇山楂果酒工艺优化正交试验结果与分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for Hovenia dulcis and hawthorn wine fermentation process optimization

分别以总酸、总酚、感官评分为响应值，采用方差分析考察各因素对正交试验结果的影响，结果分别见表9～11。

由表9～表11可知，复配体积比对发酵果酒的总酸含量、感官评分有显著性的影响（P＜0.05），初始糖度对发酵果酒的总酚含量有显著性的影响（P＜0.05）；而发酵时间、发酵温度对总酸含量、总酚含量及感官评分的影响不显著（P＞0.05）。

表9 以总酸含量为评价指标的正交试验结果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests result with total acid content as evaluation index

表10 以总酚含量为评价指标正交试验结果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal tests with total phenol content as evaluation index

表11 以感官评分为评价指标正交试验结果方差分析Table 11 Analysis of variance of orthogonal tests result with sensory score as evaluation index

2.3 验证试验

根据正交试验结果，以直观分析感官评分最高的试验8号A3B2C1D3为参照，根据总酸、总酚、感官评分为评价指标优选出的工艺组合A3B3C1D2、A3B3C2D1和A3B3C3D3进行验证，结果见表12。由表12可知，A3B3C3D3工艺的总酚含量（270.59±2.00）mg/100 mL、感官评分（81.34±2.10）分最高，选择其为最适发酵工艺，即体积比60∶100、初始糖度21.0%、发酵时间10 d、发酵温度25 ℃。在此条件下复合果酒酒液澄清透亮，酒体颜色呈现金黄，无悬浮沉淀，酒香浓郁，酒体丰厚但口感稍酸，回味悠长，酒精度为11.34%vol，总酸为14.40 g/L，总酚为270.59 mg/100 mL，感官评分为81.34分。

表12 最佳工艺验证结果Table 12 Validation tests results of the optimal process

2.4 枳椇山楂果酒抗氧化能力

果酒及VC对DPPH自由基及ABTS+自由基清除能力的测定结果见图1。由图1A可知，稀释10倍枳椇山楂酒的DPPH自由基清除能力高于0.3%VC和枳椇果酒，表现出较高的DPPH自由基清除能力，其研究结果与唐兰芳等[30]枳椇发酵酒DPPH自由基清除率曲线相一致；在样品量为0.4 mL时DPPH自由基清除率分别为（89.92±0.06）%、（95.27±0.05）%、（91.57±0.12）%，且三者存在显著性差异（P＜0.05）；其中枳椇山楂果酒与枳椇果酒较0.3%VC的DPPH自由基清除能力较优。

由图1B可知，稀释10倍的枳椇山楂果酒表现出更高的ABTS+自由基清除率，稀释10倍的枳椇山楂果酒在用量0.28 mL前清除率高于0.3%VC液和枳椇果酒，用量在0.28 mL之后，0.3%VC液高于稀释10倍的枳椇山楂果酒和枳椇果酒；在样品量0.30 mL其ABTS+自由基清除率分别是（92.86±0.14）%、（96.79±0.36）%以及（74.07±0.36）。之后随着样品量的增加，添加山楂汁发酵的枳椇山楂果酒的ABTS+自由基清除能力也始终高于枳椇果酒。

图1 不同样品DPPH自由基（A）及ABTS+（B）清除能力比较Fig.1 Comparison of scavenging ability of DPPH free radical (A) and ABTS+(B) of different samples

3 结论

本研究运用单因素试验结合正交试验设计的基础上分析得出了枳椇山楂果酒酿造的最优工艺参数：复配比例60∶100、初始糖度21%、发酵温度25 ℃、发酵时间9 d，此条件下得到的枳椇山楂果酒酒香浓郁、伴随青木香、入口稍酸、颜色金黄，酒精度为11.34%vol、总酸含量为14.69 g/L、总酚含量为280.59 mg/100 mL、感官分值为81.34。稀释10倍枳椇山楂复合果酒其DPPH自由基与ABTS+自由基清除能力均优于枳椇果酒。