生物荧光酶抑制法快速定性测定粮食中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留

马 宏， 吴 宇， 陈晋莹， 古艳婷， 李 丽，胡 莎， 张震昊， 叶 金， 王松雪

(新疆维吾尔自治区粮油产品质量监督检验站1，乌鲁木齐 830000)(国家粮食和物资储备局科学研究院2，北京 102629)(中储粮成都储藏研究院有限公司3，成都 610000)(北京中检葆泰生物技术有限公司4，北京 100176)(青岛市粮油质量检测和军队粮油供应中心5，青岛 266042)

有机磷类和氨基甲酸酯类农药[1]是目前最常用的农药之一，广泛用于粮食作物的生产和储藏中，过量残留在粮食作物上的农药可经消化道、呼吸道及完整的皮肤和黏膜进入人体，对人体造成不同程度的损害，影响人们的健康。近年来，粮食作物中因为农药残留超标的报道时有发生。因此，建立粮食中农药残留检测方法，对于加强粮食质量安全水平，有着重要的现实意义。

有机磷类和氨基甲酸酯类农药种类多，化学性质差异大，因此检测难度较大，常用的检测方法包括高精密仪器分析方法和快速检测方法。现有的高精密仪器分析方法主要有液相色谱[2-6]、液相色谱-质谱联用[7-15]、气相色谱[16-19]、气相色谱-质谱联用[20-26]等，虽然色谱类方法使农药残留分析从一种或几种农药发展到可同时测定几十种至上百种不同种类的农药，实现了对农药的高通量，高灵敏度的定性、定量检测、结果准确可靠、灵敏度高，但由于需要大型的色谱、质谱设备，检测成本高，同时对操作人员技术水平要求高，适合国家及省级检测站使用，限制了其在基层实验室及收购现场的应用。快速检测方法由于具有操作简便，检测时间短，成本低，无需大型仪器等优势，适合于现场的快速筛查。目前的快速检测方法主要包括化学速测法[27]、免疫分析法[28, 29]、酶抑制法[30-33]和生物荧光法[34]等。化学速测法主要根据氧化还原反应，水解产物与检测液作用变色，常用于有机磷农药的快速检测，但是化学速测法灵敏度低，使用有局限性，且易受还原性物质干扰，因此应用较少；免疫分析法最常用的是酶联免疫分析法(ELISA)，以抗原与抗体的特异性、结合反应的可逆性为基础的检测技术，灵敏度高、选择性好，但通常只能检测一种农药，无法进行多残留检测；而酶抑制法是在基于农药能抑制动植物体内某些特定的生物酶活性，通过肉眼或仪器观察显色反应，从而对样品中的农残进行定性检测，因具有快速、操作简便、成本低廉等特点而被广泛应用，但是传统的酶抑制法采用的是乙酰胆碱酯酶，此方法灵敏度较低，许多目标物的灵敏度无法满足国家限量要求。

本研究采用经过改良的昆虫酯酶，其与农药残留的结合能力远高于传统的乙酰胆碱酯酶，并且底物经过修饰，增加了酶与底物的特异性结合能力；同时用高灵敏的荧光底物代替传统的显色底物，进一步提高了方法的灵敏度，可同时检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药及其代谢物，样品处理简单，无需纯化，谷物粮食只需简单提取，检测速度快，可在20 min内完成多个样品的检测，另外，实验过程无需标准品，同时对实验人员技术水平要求低，因此，既适用于粮油收储单位和粮油加工企业进行粮食收储验质，同时适用于粮油质量监测机构进行粮食质量监管，大大提高检测效率，降低检测成本。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Novalum-Ⅱ生物荧光检测仪，INC-220-LUM孵育器，涡旋振荡器，离心机；丙酮、乙酸乙酯(色谱纯)；无水硫酸钠；昆虫酯酶、荧光素酶受体；敌敌畏、对硫磷、甲萘威、克百威、辛硫磷、杀螟硫磷、甲拌磷、乐果、毒死蜱、马拉硫磷；玉米全粉空白(有机磷类和氨基甲酸酯类)、小麦全粉空白(有机磷类和氨基甲酸酯类)、稻谷全粉空白(有机磷类和氨基甲酸酯类)。

1.2 仪器条件

生物荧光检测仪条件：PMT荧光信号采集器，激发波长：460～550 nm，发射波长590 nm；孵育器：温度≥35 ℃。

1.3 样品前处理方法

称取0.5 g(精确至0.01 g)样品于10 mL的离心管中，加入2 mL 20%无水硫酸钠溶液，再加入2 mL乙酸乙酯-丙酮(95∶5)溶液，混匀。在4 500 r/min下离心2 min，取100 μL上清液至2 mL离心管中，在45 ℃下用吹至近干。加入1 mL 水复溶，此溶液为待测溶液。

1.4 样品测定

准确移取100 μL待测溶液加入到检测微管中，然后加入50 μL昆虫酯酶溶液，混匀。将微管置于35 ℃的孵育器中孵育10 min。接着向检测微管底部加入50 μL酶受体溶液，混匀。将微管置于35 ℃的孵育器中，孵育5 min。向检测微管加入1 mL荧光底物溶液，用生物荧光检测仪读取检测结果。

1.5 限量酶抑制率计算和结果判定

以GB 2763—2019[35]食品中农药最大残留限量为基础，进行空白基质限量浓度加标，测试3 d，每天测试6个平行样品，合计18个样品计算方法的平均酶抑制率和标准偏差。利用统计假设检验理论中一尾检验(one-tailed test)原理，当a=0.05时，18个平行样品结果统计的t值为1.74，得到限量酶抑制率计算公式为：

yMRL=(ym-1.74S)×100

式中：yMRL为限量酶抑制率/%；ym为空白基质限量浓度加标的抑制率平均值；S为标准偏差。

当检测结果低于限量酶抑制率时，样品符合要求，即为阴性。当结果高于限量酶抑制率，样品为疑似不符合，即疑似阳性，需使用仪器方法复检。

2 结果与讨论

2.1 反应时间优化

测定样品提取液与酶溶液反应时间对酶抑制率的影响，荧光素底物溶液和荧光素酶溶液的体积为50 μL，反应温度为35 ℃，考察了3、5、8、10、13、15 min等不同反应时间下酶抑制率情况反应时间在10 min内时随着时间的延长，酶抑制率会增加，当反应时间达到10 min后，酶抑制率随着时间的延长没有明显的增加，因此选择10 min作为样品提取液与酶溶液的最佳反应时间。

本方法可同时处理7份粮食样品，样品称量、提取、离心、氮吹、复溶等前处理时间约20 min，提取液与酶溶液的反应时间为10 min，荧光素酶受体反应时间为5 min，即样品检测时间为15 min。因此整个方法同时处理7份粮食样品所需时间约为35 min，平均每份样品5 min。

2.2 反应温度对酶抑制率的影响

测定样品提取液与酶溶液反应温度对酶抑制率的影响，荧光素底物溶液和荧光素酶溶液的体积为50 μL，考察了25、30、35、40、45 ℃等不同反应温度，在一定温度范围内，随着温度的升高，昆虫酯酶抑制率会增加，当温度达到35 ℃后，昆虫酯酶的抑制率达到最大，随着温度继续升高昆虫酯酶的抑制率会明显下降，因此选择35 ℃作为样品提取液与酶溶液的最佳反应温度。

2.3 判定方法确定

粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯农药种类高达150种，为了便于快速筛查，目前传统的酶抑制法规定的判定方法均基于一个固定值进行判定，如GB/T 5009.199—2003[36]的判定方法是根据抑制率是否大于50%来判断，当抑制率大于50%时，结果为阳性，小于50%时，结果为阴性。但由于有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留种类多，限量浓度相差大，相同农药不同品种样品间的限量浓度也可能不同，这些因素都会导致农药的阳性抑制率不在50%左右。 因此，按照GB/T 5009.199—2003中单一的使用抑制率50%作为结果的判定标准，必然导致方法筛查的准确性降低。

表1为部分常见农药在食品安全国家标准限量浓度下的抑制率，可以看出，多数农药限量浓度抑制率不在50%，直接采用50%抑制率进行判定，容易产生较高的假阳性率和假阴性率，导致筛查的结果不准确。

表1 部分常见农残的限量浓度时的酶抑制率

对于农残的快速筛查方法而言，主要为了判定结果是否超过国家标准限量浓度。因此本实验基于实用性考虑，以GB 2763—2019限量浓度下农药的酶抑制率进行判定。通过比较样品和目标农药残留限量浓度的酶抑制率大小进行结果判定，当样品抑制率高于目标农药残留限量浓度的酶抑制率时，表示样品中可能有高剂量该类目标有机磷类或氨基甲酸酯类农药残留存在，样品判定为疑似阳性样品，对疑似阳性样品，需用参考方法进一步复检，确定具体农药的种类和含量。当样品的抑制率低于判定抑制率，表示样品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留较低，该样品判定为阴性样品。同时报告时应标明对何种目标农药残留呈疑似阳性或阴性。

2.3.1 选择目标农药种类

为了确认本方法的适用性，对不同类型的用户对于农药快速检测需求进行摸底调研。包括大型农场主，粮食加工企业，粮油质检站和食药部门等不同行业的用户，调研结果如表2所示。

表2 农药快检需求调研

大部分的用户使用过程中都有一个目标农药列表，且农残数量不超过5～10种。因此为了提高方法筛查的准确性，可以利用现有已知条件，尽量减少目标物范围，提高判定结果准确度。根据检测农药列表、样品基质种类，可以有效排除一大批该基质种类无限量要求的农药，根据样品的来源及产地农残监测情况和施药指南情况，可以进一步降低目标农药种类，缩小到尽量少的范围内，确定可能的目标农药种类，提高方法的准确性。根据确定的目标农药，选取其中最低的限量抑制率作为判定抑制率，可以尽量减少假阴性的发生，提高快速的筛查的准确性。

2.3.2 限量酶抑制率

农药的限量酶抑制率是本方法判定的基准，确定限量浓度下该农药对酶抑制率对于结果的判定十分关键。通过查阅和调研国内外相关文献资料，欧盟法规Commission Regulation (EU) No 519/2014[37]规定了针对快速筛查方法的结果判定方法。利用检测结果与判定值比较进行结果的判定，当检测结果低于判定值时，样品符合要求，即为阴性。当结果高于判定值，样品为疑似不符合，即疑似阳性，需使用仪器方法复检。其中判定值的获得非常关键，欧盟法规中给出了具体的计算方法。根据筛查的目标浓度，针对不同的种类，分别进行该浓度下的检测结果平均值RSTC及标准偏差SDSTC，利用统计假设检验理论中一尾检验原理，计算95%的概率时的值作为判定值，确保判定结果正确率大于95%。

2.3.3 5种农药酶限量抑制率

实验选择5种常用农药敌敌畏、对硫磷、甲萘威、克百威和辛硫磷，通过比较2种不同判定方法结果的准确性情况，以0.5倍、1倍、2倍限量浓度3种浓度空白糙米样品加标，判定结果数和方法假阴性率，假阳性率和正确率，结果如表3所示。

表3 判定结果

其中判定一按照本实验设定的判定方法(见1.5 限量酶抑制率计算和结果判定)，以限量酶抑制率为判定基准，判定二根据GB/T 5009.199—2003规定，以抑制率50%为判定基准。由于GB/T 5009.199—2003的判定为单一的评价方式(根据抑制率为50%判断)，对于限量抑制率不在50%附近的农药而言，其准确性较差，如甲萘威(限量抑制率为65.08%)，辛硫磷(限量抑制率为40.62%)的正确率只有63%和33%。本实验中利用限量抑制率判定，可以准确得到各个农药的限量抑制率，利用其真实的限量抑制率而不是通用的抑制率50%进行判定，使得单个农药的判定假阳性率，假阴性率都有显著的降低，正确率从原来的33%～78%提升至74%～94%，显著提高了方法的准确性。

2.4 方法的检出限

本方法的检出限汇总见表4。通过空白基质加标样品逐级稀释得到信噪比的3倍作为检出限，可以满足粮食中有机磷和氨基甲酸酯限量检测的要求。

表4 本方法检出限汇总

表5 实验室间验证结果

2.5 方法的准确度、重复性和再现性验证

为了验证方法的准确度、重复性和再现性，选择10个实验室进行验证，结果见表5。验证样品包括空白玉米样品，空白小麦样品，空白稻谷样品，加标浓度水平为0.5倍、1倍、2倍限量浓度3个水平。对10个实验室返回的3 087个检测结果根据GB/T 6379.2—2004[38]，采用柯克伦检验和格拉布斯检验剔除离群值。结果显示，本次验证2倍限量浓度加标水平样品无假阴性发生，1倍限量浓度加标水平样品的假阴性率<5%，0.5倍限量浓度加标水平样品的假阳性率<30%，说明本方法在各实验室的准确性良好。重复性相对标准偏差RSDr<10% 的占76.2%，RSDr<15% 的占95.2% ，说明本方法在各实验室的重复性良好。再现性RSDR<15% 的占66.7 %;RSDR<25% 的占95.2% ，说明本方法实验室间再现性良好。

2.6 方法实际应用

为了更好地验证方法实际使用效果，收集2018年度某小麦主产区共58份小麦样品。使用本方法进行快速筛查，其中71%的样品抑制率小于30%，91%样品抑制率小于40%，使用仪器方法对所有样品进行复检，结果显示超标样品2份，均为辛硫磷超标。表6为模拟不同的情况下本方法的判定结果的准确性。当检测目标农药只有辛硫磷，该情况下的判定抑制率即为小麦辛硫磷限量抑制率，准确率高达96.5%。当检测目标农药为5种常见的农药(敌敌畏、对硫磷、甲萘威、克百威、辛硫磷)，选取其中最低限量抑制率，即敌敌畏的限量抑制率36.95%，以36.95%作为判定抑制率，最终准确率为91.4%。当检测目标农药为10种常见的农药(敌敌畏、对硫磷、甲萘威、克百威、辛硫磷、乐果、杀螟硫磷、甲拌磷、毒死蜱、马拉硫磷)，选取其中最低限量抑制率为毒死蜱的32.56%，故以32.56%作为判定抑制率，最终准确率为86.2%。这3种情况下，所有结果均无假阴性，且假阳性率较低，准确率较高，说明本方法可以很好地用于基层现场农药残留的快速筛查。

表6 不同情况下58份小麦样品快检结果准确率

3 结论

本研究通过样品提取液与酶溶液的反应时间、反应温度对酶抑制率的影响，确定了样品提取液与酶溶液的最佳反应时间为10 min，最佳反应温度为35 ℃。在此基础上，确定限量酶抑制率为判定方法，即以GB 2763—2019限量浓度下农药的酶抑制率进行判定。以敌敌畏、对硫磷、甲萘威、克百威和辛硫磷5种农药为例，通过限量酶抑制率和传统50%抑制率2种判定方法进行比较，限量酶抑制率判定方法可以使单个农药的假阳性率，假阴性率都有显著的降低，方法的准确性有显著提高，从原来的33%～78%提升至74%～94%。同时本研究选择了10家实验室对方法的准确度、重复性和再现性进行验证。在实际应用实验中，对58份样品用本方法进行筛查，同时用仪器方法进行复检，本方法检测结果具有较高的准确性。本方法操作简单，检测时间短，本方法形成粮食行业标准LS/T 6139—2020 《粮油检验 粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测》，可以很好地用于基层现场粮食中农药残留的快速筛查。