磷酸二酯酶PA4781对铜绿假单胞菌运动能力及毒力的影响

宋瑾萱，张倩楠，王秀青

(宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750004)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是假单胞菌属中的主要种别，在自然界中普遍存在，是极易引起医院感染的革兰阴性条件致病菌。该菌感染主要见于免疫力低下者，如幼儿、年老体弱者，患有恶性肿瘤、艾滋病等免疫功能受损的患者。

环二鸟苷酸(cyclic-diguanosine monophosphate, c-di-GMP)作为细菌内广泛存在的一类第二信使分子，参与调节细菌运动、黏附、毒力以及生物膜形成等多种生理活动，在微生物感染过程中发挥重要作用[1]。细菌胞内c-di-GMP浓度取决于其在胞内的合成与分解速率。含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)可将两分子的GTP合成c-di-GMP，而含EAL和HD-GYP结构域的特异性磷酸二酯酶(PDEs)又可将合成的c-di-GMP催化水解[2]。HD-GYP是参与细菌第二信使分子c-di-GMP水解的蛋白质结构域。在霍乱弧菌(Vibriocholerae)El Tor体内，HD-GYP蛋白过表达降低细胞内c-di-GMP浓度，减少胞外多糖的产生和生物膜形成[3]。铜绿假单胞菌PAO1基因组编码三种具有HD-GYP结构域的蛋白：PA4781、PA4108和PA2572。并且PA4781、PA4108和PA2572的突变对铜绿假单胞菌的生物膜形成及运动能力有明显的影响[4]。

PA4781是c-di-GMP的磷酸二酯酶，参与c-di-GMP降解，c-di-GMP影响细菌的运动、生物膜的形成等生理生化过程[4]。众多生理过程中，运动能力尤为重要，铜绿假单胞菌的运动能力包括泳动(swimming)、丛动(swarming)和蹭行运动(twit-ching)，已被证明与其生物膜形成和致病力都具有显著的联系[5]。胞外多糖是细菌生物膜最主要的组成成分，在生物膜发育中具有关键作用。铜绿假单胞菌可以分泌3种胞外多糖，即Psl、Pel和藻酸盐[6]。Pel多糖和Psl多糖都可以作为生物被膜基质的关键结构成分，不同的胞外多糖对铜绿假单胞菌的毒力因子及形成生物被膜的能力都有不同的影响。胞外DNA与胞外多糖一样，在细菌生物膜形成的初始阶段也发挥重要作用。胞外积累的 DNA 构成生物膜的骨架，与胞外多糖共同作用来维持生物膜的稳定性[7]。此外，铜绿假单胞菌能够分泌许多的胞外毒力因子导致宿主细胞的感染，比如绿脓菌素、外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂等[8]。绿脓菌素不但易渗透细胞膜，而且能干扰来自宿主细胞内过氧化氢酶和电子的转移过程，产生活性氧(ROS)[9]，被认为是主要的毒力因子。弹性蛋白酶是铜绿假单胞菌产生的3种具有广泛特异性底物蛋白酶中的一种，这种酶具有组织损伤活性，在局部感染中起重要作用[10]。因此，铜绿假单胞菌的毒力因子及运动能力在病原菌感染时起重要作用，研究其机制对防治铜绿假单胞菌感染具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 铜绿假单胞菌PA03为临床分离株，由宁夏医科大学总医院实验中心提供，PA4781过表达株pMP2444-PA4781及敲除株pnCasPA-BEC-ΔPA4781为本实验室构建和保存[11]，均为单株。

1.1.2 培养基 LB培养基；丛动培养基(g/L)：LB培养基，葡萄糖5 g，琼脂粉5 g，定容至1 L，105Pa灭菌20 min；泳动培养基(g/L)：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉3 g，定容至1 L，105Pa灭菌20 min。

1.1.3 试剂及仪器设备 硫酸庆大霉素，北京Solarbio公司；细胞/细菌总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；RNA反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR仪、凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；电泳仪，北京六一仪器厂；ABI7500 PCR仪，美国Thermo公司。

1.1.4 引物设计与合成 利用NCBI数据库及Primer Premier 6.0软件，设计相关基因及1个内参基因(RpoD)的引物序列，用BLAST检验引物的特异性，并送由上海生工公司合成。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 复苏铜绿假单胞菌野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及过表达菌株pMP2444-PA4781于LB平板上37℃倒置培养15 h后，挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃ 180 r/min震荡过夜培养(为维持质粒稳定性，需在敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及过表达菌株pMP2444-PA4781培养基中加入庆大霉素)，取1%菌液进行放大培养约2.5 h，调整菌液浓度至0.5麦氏单位。

1.2.2 细菌运动试验 提前配制好3种运动所用的培养基，灭菌后冷却至40℃倾注平板，室温放置，使培养皿盖上的水蒸气蒸发后备用；泳动和丛动试验分别吸取2 μL调好浓度的菌液点在平板标记位点；蹭行运动试验先用枪头将培养基穿透，于穿透的地方轻点2 μL调好浓度的菌液。待菌液被培养基吸收后，平稳移入37℃培养箱，培养24 h后观察结果。

1.2.3 刚果红染色法检测胞外多糖 提前准备好LB平板，其中含有20 μg/mL的考马斯亮蓝、40 μg/mL的刚果红；吸取5 μL调好浓度的菌液轻点于LB平板中央，待菌液稍干后移入37℃培养箱，培养48 h后观察结果。

1.2.4 苯酚-硫酸法检测胞外多糖 取调好浓度的菌液于4℃下13 000 r/min离心20 min，上清液用0.22 μm过滤器除菌，向过滤后的上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜沉淀，次日4℃下13 000 r/min离心15 min，弃上清，用1 mL蒸馏水重悬管壁上的胞外多糖沉淀。

称取2.5 mg标准葡萄糖，于25 mL的容量瓶中，制成100 mg/L的标准葡萄糖溶液。准确吸取标准葡萄糖溶液10、20、30、40 μL，加蒸馏水补足至100 μL，配制成浓度分别为10、20、30、40 μg/mL的葡萄糖溶液，加入200 μL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速滴加500 μL浓硫酸，混匀后室温放置10 min，40℃水浴锅加热15 min，取出室温静置5 min冷却后于490 nm处测定吸光度值。以标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

分别取不同菌株的胞外多糖沉淀，按同样的方法进行显色，将所得值带入标准曲线计算得到相应的多糖含量。

1.2.5 生长曲线测定 分别取过夜培养的菌液，用酶标仪测量其在600 nm的OD值，用LB培养基稀释至菌液OD初始值为0.05，接种至96孔板，放置于摇床180 r/min，37℃培养，每隔2 h用酶标仪测量其在600 nm处的OD值，至24 h。用不同时间测定获得的不同OD值绘制菌株生长曲线。

1.2.6 胞外DNA试验 分别取培养6、12、24、36 h的野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及过表达菌株pMP2444-PA4781的菌液1.5 mL 10 000 r/min离心10 min，取上清液与两倍体积冰冻保存的无水乙醇充分混匀后放入-20℃冰箱30 min，取出后12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 mL 70%乙醇(-20℃预冷)，随即12 000 r/min离心10 min，弃上清，放入超净工作台中吹干多余液体，向其中加入20 μL双蒸水-20℃保存。次日取各个样品在1%琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测基因转录水平的变化 取复苏后野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及过表达菌株pMP2444-PA4781于LB液体培养基中37℃，180 r/min震荡过夜，过夜培养后，取1%菌液放大培养5 h，按照细胞/细菌总RNA提取试剂盒说明操作，提取细菌总RNA，并测定其浓度在合适范围内。

加入各RNA样品500 ng，按RNA反转录试剂盒说明操作，42℃孵育15 min，85℃加热5 s失活EasyScript RT/RI与gDNA Remover，将提取出的RNA反转录为cDNA，-20℃冷冻保存。

以RpoD为内参，以cDNA为模板，引物序列见表1，按照RT-qPCR试剂盒说明进行操作。反应条件为：94℃预变性 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，45 cycles，60℃单次采集荧光，绘制熔解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。

1.2.8 胞外蛋白酶检测 在LB培养基中加入20%的脱脂奶粉溶液10 mL，混匀后倾注平板；将不同检测菌株调成0.5麦氏单位菌液，吸取菌液5 μL轻点于牛奶平板中央，待菌液干燥后将平板正置于37℃培养24 h。观察牛奶平板中蛋白被水解的透明圈，并测量、记录其直径，即为蛋白酶水解能力。

2 结果

2.1 PA4781对细菌运动能力的影响 为研究PA4781对铜绿假单胞菌运动能力的影响，分别测定野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及过表达菌株pMP2444-PA4781的泳动、丛动和蹭行运动能力。测量细菌运动直径并进行统计分析，相比于野生型菌株PA03，PA4781敲除菌株的泳动能力减弱，PA4781过表达菌株的泳动能力增强，差异有统计学意义(P<0.001)，见图1。与PA03野生型菌株相比，PA4781敲除菌株的丛动能力减弱，PA4781过表达菌株的丛动能力增强，差异有统计学意义(P<0.001)，见图2。相比于PA03野生型菌株，PA4781敲除菌株的蹭行运动能力减弱，PA4781过表达菌株的蹭行运动能力增强，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

进一步研究PA4781与蹭行运动相关的PilZ基因转录水平的影响，结果表明，与野生型菌株PA03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的PilZ mRNA的相对表达量下降，过表达菌株pMP2444-PA4781的PilZ mRNA的相对表达量增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

2.2 PA4781对细菌胞外多糖的影响 对铜绿假单胞菌胞外多糖的表型进行观察，结果显示，相比于野生型菌株PA03，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781刚果红染色加深，分泌的胞外多糖增多；过表达菌株pMP2444-PA4781染色变浅，分泌的胞外多糖减少，见图5。

采用苯酚-硫酸法定量测定铜绿假单胞菌胞外多糖的量，绘制葡萄糖溶液的标准曲线，见图6。标准回归曲线方程为y=0.000 89x+0.108 4，相关系数R2=0.992 4，多糖含量的高低与吸光度呈线性关系。然后由标准曲线回归方程计算出野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及过表达菌株pMP2444-PA4781的糖浓度，并计算样品糖含量。结果显示，与野生型菌株PA03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的胞外多糖产量增多；过表达菌株pMP2444-PA4781的胞外多糖产量减少，差异有统计学意义(P<0.001)，见图7。

PelA(PA3064)是Pel多糖合成位点基因之一。通过RT-qPCR检测PA4781对PelA基因转录水平的影响。结果显示，与野生型菌株PA03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的PelA mRNA的相对表达量增高，过表达菌株pMP2444-PA4781的PelA mRNA的相对表达量下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见图8，与胞外多糖的表型变化一致。

2.3 PA4781对细菌胞外DNA的影响 绘制野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781以及过表达菌株pMP2444-PA4781的生长曲线，结果显示，在0～12 h，3株菌株均呈对数生长状态，11 h达到平台期，之后生长趋于平缓。对3株菌株生长曲线进行统计学分析，差异无统计学意义(P>0.05)，见图9。电泳结果表明，从6 h开始，胞外DNA开始积累，随时间推移，含量逐渐增多，24 h达到最大；36 h胞外DNA含量已下降。在12、24 h，野生型菌株PA03的胞外DNA大量积累，相比于野生型菌株PA03，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和过表达菌株pMP2444-PA4781的含量相对较少，见图10。

2.4 PA4781对PhzM基因表达的影响 通过RT-qPCR研究控制绿脓菌素产生的基因PhzM(PA4209)mRNA的变化。结果显示，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和过表达菌株pMP2444-PA4781的PhzM mRNA的相对表达量低于野生型菌株PA03，差异有统计学意义(P<0.01)，见图11。

2.5 PA4781对细菌胞外蛋白酶的影响 通过对菌斑在牛奶平板中透明圈的直径进行测量并统计分析，与野生型菌株PA03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和过表达菌株pMP2444-PA4781的蛋白酶水解能力均有下降，差异有统计学意义(P<0.001)，见图12。

3 讨论

铜绿假单胞菌是引起医院感染的主要条件性致病菌之一。c-di-GMP作为细菌中普遍存在的第二信使，不但能够调控鞭毛和纤毛的形成，而且还能通过调控因子或与蛋白结合来间接或直接地调控细菌的运动性[12]。铜绿假单胞菌的运动包括泳动、丛动和蹭行运动，这些运动能力在感染过程中发挥着至关重要的作用。细菌的泳动主要依赖于鞭毛提供动力[13]，丛动依赖于鞭毛和Ⅳ型菌毛的共同作用，蹭行运动同样依赖于鞭毛的运动和Ⅳ型菌毛的伸展和收缩，使得铜绿假单胞菌在感染时可以迅速到达感染部位，有利于生物膜的黏附和形成[14]。生物膜的形成增强了细菌抵御宿主免疫防御系统及抗菌药物的能力，同时鞭毛促进了细菌的迁移和扩散，进而促进病原菌与宿主的相互作用[15]。铜绿假单胞菌的运动能力、生物膜的形成及毒力因子的产生都对患者的感染及迁延不愈有重要的影响，因此，对于相关表型的研究尤为重要。

PA4781是铜绿假单胞菌中含有HD-GYP结构域的磷酸二酯酶，能够促进c-di-GMP水解。细胞表面附属物(主要为鞭毛和Ⅳ型菌毛)通过影响细菌迁移和固体表面附着，在生物被膜的形成中发挥重要作用[16]。铜绿假单胞菌能够通过鞭毛的挥鞭运动在液体中泳动，并能够通过Ⅳ型菌毛的伸展和收缩在固体表面蹭行。细菌的这种迁移能力使其在发育过程中具有广泛的运动性、竞争性和选择性[17]。PilZ是一种介导蹭行运动的Ⅳ型菌毛形成所必须的，被c-di-GMP结合而激活，帮助生物被膜微菌落的聚集[18]。本研究利用本实验室前期构建的菌株，对PA4781的功能进行进一步研究。通过对其运动能力和Ⅳ型菌毛基因PilZ的研究，发现PA4781敲除菌株的运动能力弱于野生型菌株，PA4781过表达菌株的运动能力强于野生型菌株，差异有统计学意义(P<0.05)，同时PA4781敲除菌株PilZ的mRNA相对表达量低于野生型菌株，PA4781过表达菌株PilZ的mRNA相对表达量高于野生型菌株，差异有统计学意义(P<0.01)，因此说明PA4781可能通过促进基因PilZ的表达，从而增强细菌的运动能力。

研究[4]表明，PA4781对生物膜的形成有一定的影响，因此，应着重于生物膜中两个重要的组成成分，胞外多糖和胞外DNA。胞外多糖是生物膜细胞外基质的骨架成分，其黏性使菌细胞聚集形成封闭环境以抵御逆境胁迫，而c-di-GMP可经合成酶依赖途径参与调控胞外多糖的合成与转运[19]。研究[20]表明，细菌内高浓度的c-di-GMP可促进生物膜形成，低浓度的c-di-GMP可抑制生物膜形成。铜绿假单胞菌可以合成至少3种类型的胞外多糖：褐藻多糖、Pel多糖和Psl多糖。Pel多糖可以将不同种菌株连接在一起，从而促进混合生物被膜的形成[21]。Pel多糖还可以与生物被膜基质中的另一重要组分，胞外DNA通过正负离子间相互吸引而交联在一起，促进生物被膜的稳定性。

胞外DNA被认为是促进铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因子，其既可以作为生物被膜的支撑成分，也可以在营养缺乏时期为生物膜内细菌提供营养[22]。胞外DNA的主要结构与细菌基因组染色体DNA相似，其主要来源于死亡细菌的裂解、释放或活细菌的主动分泌，参与细菌细胞的初始附着、细胞-细胞的互连和生物被膜大菌落的形成。在铜绿假单胞菌生物被膜形成的初期，胞外DNA含量较少，大量DNA的释放则是在生物膜形成的晚期，这也与晚期有较多细菌死亡裂解有关[23]。

通过对胞外多糖和胞外DNA的含量进一步分析发现，相比于野生型菌株，PA4781过表达菌株的胞外多糖产生减少，PA4781敲除菌株的胞外多糖产生增加，差异有统计学意义(P<0.001)，且通过对控制Pel多糖合成的基因——PelA在转录水平的变化情况发现，相比于野生型菌株，PA4781敲除菌株PelA的mRNA相对表达量升高，PA4781过表达菌株PelA的mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01)，表明PA4781可能通过抑制基因PelA的表达，抑制生物膜细胞外基质胞外多糖的产生，从而可能抑制生物膜的形成和稳定性；而对于胞外DNA含量，研究发现在细菌增殖能力相同的情况下，12 h和24 h(生物膜成熟的阶段)时野生型菌株的胞外DNA大量积累，相比于野生型菌株，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和过表达菌株pMP2444-PA4781的含量都相对较少。说明PA4781可能不能直接影响胞外DNA的分泌。

绿脓菌素是一种具有氧化活性的吩嗪类化合物，也是铜绿假单胞菌的重要致病因子。作为铜绿假单胞菌的主要毒力因子，绿脓菌素不仅是该菌的群体感应信号分子，也是一种电化学活性代谢物。其被认为是细菌呼吸的电子载体，同时也能协调微生物群落对环境变化的反应[24]。此外，研究[25]表明，绿脓菌素可以通过诱导H2O2介导的细胞裂解促进胞外DNA的释放，从而促进生物膜的形成。在试验过程中发现，PA4781过表达菌株绿脓菌素的产生量远低于PA4781敲除菌株和野生型菌株，因此检测控制绿脓菌素的基因PhzM的表达量的变化。结果同样发现，相比于野生型菌株，PA4781过表达菌株和PA4781敲除菌株的基因表达量大幅度下降，差异有统计学意义(P<0.01)，说明PA4781可能不能直接影响绿脓菌素的合成，这也可以解释胞外DNA有同样的变化，从而引起后期深入的研究。

蛋白水解酶也是铜绿假单胞菌的重要毒力因子之一，包括弹性蛋白酶A和B、碱性蛋白酶等，对于不同的蛋白都有一定的水解能力，在急性感染中发挥重要作用。对野生型菌株PA03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和过表达菌株pMP2444-PA4781的胞外蛋白酶总活性进行检测，发现与野生型菌株PA03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和过表达菌株pMP2444-PA4781的蛋白酶水解能力均有下降，差异有统计学意义(P<0.001)，表明PA4781可能不能直接影响铜绿假单胞菌的胞外蛋白水解酶能力。

综上所述，本研究认为，PA4781可能通过促进基因PilZ的表达，从而促进铜绿假单胞菌的运动能力；PA4781可能通过抑制基因PelA的表达，从而抑制胞外多糖的分泌。同时，PA4781可能不能直接影响胞外DNA分泌量、毒力因子绿脓菌素和胞外蛋白酶的产生。

PA4781作为c-di-GMP的磷酸二酯酶，参与c-di-GMP降解，影响细菌的运动、生物膜的形成等众多生理过程。本研究基于课题组前期在PA4781对铜绿假单胞菌c-di-GMP及生物膜形成的影响方面的研究，初步探明PA4781对细菌运动能力及毒力因子的影响，但PA4781与其他因素共同作用对细菌致病因子的影响仍有待进一步探讨，以期为铜绿假单胞菌感染的治疗找到新的靶点，为预防和治疗铜绿假单胞菌感染提供新的思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。