金雀异黄素对人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用机制

冯春燕 唐宋文 黄秀榕▲ 祁明信 胡艳红

1.福建中医药大学附属第二人民医院眼科，福建福州 350003；2.福建中医药大学，福建福州 350003

研究发现雌激素对晶状体有保护作用，可减轻晶状体氧化损伤、抑制晶状体上皮细胞（lens epithelial cell，LEC）凋亡，起到防治白内障的作用[1-6]。 富含植物雌激素的中药，如补骨脂、牛膝、葛根等具有雌激素样活性[7]，在抗癌、预防心脑血管疾病等方面，具有雌激素不可替代的很多优点。金雀异黄素（genistein，GEN）又名染料木黄酮，是一种来源于豆类植物的异黄酮类化合物，其化学名为5，4，7-三羟基异黄酮。 它是有芳香环的三苯基异黄酮化合物，带有两个酚羟基的结构类似于雌二醇（β-estradiol，E2），分子量为270，能低亲合力地结合雌激素受体（estrogen receptor，ER），具有微弱雌激素样作用，其生物效应相当于E2的10-5～10-3，故有植物雌激素之称[8]。

课题组前期工作发现GEN 能够保护实验性人晶状体上皮细胞系（human lens epithelial cell B3，HLEB3）氧化损伤和减轻细胞凋亡程度[9-11]。本研究拟在探讨具有雌激素活性的中药单体GEN 防护HLE-B3 氧化损伤的基础上，采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）联合蛋白质芯片技术检测分析GEN 作用于氧化损伤的HLE-B3 后线粒体蛋白质表达谱的改变，寻求其防护HLE-B3 氧化损伤的线粒体蛋白质组学规律及作用靶点，为临床寻求防治老年性白内障的安全有效天然药物提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HLE-B3 细胞由广州中山大学眼科研究中心提供；E2粉末（Sigma，美国，纯度97%），GEN 粉末（国家药品生物制品检定所，中国，纯度96.3%），30%过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2，上海试剂总厂，中国），DMEM 培养基（DMEM，GIBCO，美国），线粒体分离试剂盒（试剂A 和试剂C，Pierce，USA）和线粒体蛋白质分离试剂盒（星汉生物科技有限公司，中国）。 自动酶标读数仪（BioTek ELX808，美国）；PBS Ⅱ+型SELDITOF-MS 及Bio-processor 96 孔蛋白质芯片工作平台（美国）；Biophotometer 6131 蛋白核酸测定仪 （德国）；常温离心机（Heraeus Inc.，德国）；低温离心机（Beckman Coulter Avanti J-20，德国）。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3 培养及传代 ①将冻存细胞的冻存管立即放入37℃水中解冻，将细胞悬浮液在培养基中稀释10 倍，离心半径10 cm，以1000 r/min 离心5 min，去上清，然后磷酸盐缓冲液洗涤3 次。 ②以5×105个/ml细胞接种于培养瓶中， 并在37℃、5%CO2培养箱培养。 ③待2～3 d 细胞生长融合后进行传代培养。

1.2.2 分组 将HLE-B3 分为四组，正常组、H2O2组、E2组 和GEN 组。 正常组：HLE-B3+DMEM 培 养液；H2O2组：HLE-B3+DMEM 培养液+H2O2（终浓度300 μmol/L）；E2组：HLE-B3+DMEM 培养液+H2O2（终浓度300 μmol /L）+E2（终浓度×10-8mol/L）；GEN组：HLE-B3+DMEM 培养液+H2O2（终浓度300 μmol/L）+GEN（终浓度×10-6mol/L）。

1.2.3 SELDI-TOF-MS 联合蛋白质芯片技术检测HLE-B3 线粒体蛋白质组的变化 ①收集2×107个细胞于2.0 ml 微量离心管A，离心半径15 cm，2259 r/min，2 min，弃上清；②加800 μl 线粒体分离试剂A 于离心管A，漩涡5 s，冰上孵育2 min；③细胞悬液转于冰冷的杜恩斯组织研磨器充分匀浆细胞，然后匀浆液移到原离心管A 中，加800 μl 线粒体分离试剂C 和200 μl线粒体分离试剂A，混匀，离心半径15 cm，2050 r/min，10 min，4℃；转上清液于离心管B，离心半径15 cm，4244 r/min，15 min，4℃；转上清液于离心管C，加500 μl线粒体分离试剂C，离心半径15 cm，8490 r/min，5 min，4℃，弃上清，所得沉淀即为HLE-B3 线粒体。 ④加200 μl 线粒体蛋白质提取试剂，4℃振荡15 min，混合，离心半径15 cm，8490 r/min，15 min，4℃。 提取上清液后，测定蛋白质浓度，调整为5 mg/ml。 ⑤每个线粒体蛋白样品与CM10 芯片组合，每个处理组的芯片上有3 个点。向每个样品点加入结合缓冲液（50 mmol/L乙酸钠，pH 值4.0，3 μl），浸泡3 次，每次5 min。 取出缓冲液，立即加入5 μl 缓冲液，将蛋白质样品稀释至1.8 mg/ml。 在室温下1 h 后，除去缓冲液，每个斑点加入3 μl 结合缓冲液，5 min 后除去，该过程重复3 次。将HPLC 级水（3 μl）加入每个斑点，然后立即除去，该程序重复2 次。 ⑥芯片风干20 min，加入能量吸收分子SPA 溶液，然后空气干燥，采用统一分析参数，激光强度设置为185， 检测灵敏度为7， 检测上限为100 000 质荷比，优化采集数据范围为2000～20 000 m/z，信号采集位置为20～80，每个样本平均有144 个点。

1.3 数据处理与统计分析

使用Proteinchip 软件3.2 以xlm 格式导出初始数据。SELDI-TOF-MS 数据以为均数±标准差（±s）表示。 浙江大学癌症研究所设计的ZUCI-Protein Chip数据分析系统进行统计分析。通过统计过滤结合模型依赖性筛选的方法选取特征向量。 通过Kruskal-Wallis 秩和检验分析每个质荷比。 通过Nemenyi 检验对四组中质荷比的蛋白质峰值进行两两比较，以P＜0.05 为有统计学意义[12]。

2 结果

2.1 H2O2 对HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响

经H2O2作用的HLE-B3 在CM10 芯片结合的蛋白点有50 个， 其中质荷比为6532 和6809 的2 个蛋白点的峰值高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1、图1～2）。

表1 H2O2 对HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响（n=3，±s）

表1 H2O2 对HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响（n=3，±s）

6532 6809 107.76±70.84 109.59±31.19 1460.72±267.57 522.09±200.20+13.6+4.8质荷比 峰值改变倍数平均峰值正常组 H2O2 组

2.2 E2 对H2O2 诱导氧化损伤的HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响

经E2作用于H2O2诱导氧化损伤的HLE-B3 在CM10 芯片结合的蛋白点有46 个，其中质荷比为6532的蛋白点的峰值（519.59±138.72）低于H2O2组的（1460.72±267.57），为H2O2组的2.8 倍，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.3 GEN 对H2O2 诱导氧化损伤的HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响

经GEN 作用于H2O2诱导氧化损伤的HLE-B3在CM10 芯片结合的蛋白点有49 个，其中质荷比为6532 和6809 这2 个蛋白点的峰值低于H2O2组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2、图4～5）。

表2 GEN 对H2O2 诱导氧化损伤的HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响（n=3，±s）

表2 GEN 对H2O2 诱导氧化损伤的HLE-B3 线粒体蛋白质组的影响（n=3，±s）

6532 6809 1460.72±267.57 522.09±200.20 420.22±449.56 109.98±59.92-7.6-4.7质荷比 峰值改变倍数平均峰值H2O2 组 GEN 组

3 讨论

Nordgaard[13]从人眼库的眼球中分离出视网膜色素上皮细胞的线粒体蛋白质，经双向电泳，质谱分析，发现年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD) 较正常组有八个差异表达蛋白位点，提示AMD 的发生与线粒体功能障碍有关。 Saraswathy等[14]发现视网膜线粒体蛋白水平在实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveoretinitis，EAU）早期阶段对氧化应激的反应。

课题组前期研究发现：GEN 可提高由H2O2诱导氧化损伤的HLE-B3 内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低膜脂质过氧化产物丙二醛（malonaldehyde，MDA）的含量，以及升高线粒体膜电位，表明GEN 发挥了雌激素样作用，能够保护实验性HLE-B3 氧化损伤和减轻细胞凋亡程度[11-13]。

本实验H2O2组检测到的蛋白点有50 个，E2组检测到的蛋白点有46 个，GEN 组检测到的蛋白点有49个。其中，用H2O2诱导HLE-B3 氧化损伤后，出现质荷比为6532 和6809 两个差异的蛋白点表达均上调；E2作用于氧化损伤的HLE-B3 后， 出现质荷比为6532 蛋白点表达下调；GEN 作用于氧化损伤的HLE-B3 后，出现质荷比为6532 和6809 两个蛋白点表达下调。说明GEN 在防护由H2O2所致HLE-B3 氧化损伤的同时，也引起HLE-B3 线粒体差异蛋白的表达，质荷比为6532 的蛋白点可能是GEN 防护H2O2诱导的HLE-B3 氧化损伤的重要的作用靶点。 质荷比为6532的蛋白点在Swiss-Prot 数据库中检索的匹配蛋白质，明确与人晶状体上皮细胞凋亡、细胞氧化损伤和老年性白内障相关的蛋白质只有一种，即40S 核糖体蛋白S29（ribosomal protein S29，RPS29）。

线粒体核糖体蛋白（mitochondrial ribosomal pro teins，MRPs）是线粒体核糖体（mitochondrial ribosome）的重要组成部分，其中任何一种发生突变或缺失也会影响到线粒体蛋白的合成而导致线粒体疾病。MRPs 有两个亚基：大亚基MRPL（60S）和小亚基MRPS（40S）[15]。 Zhang 等[16]发现编码MRPL21、L15、L13a 和L7a 的基因的表达在老年性白内障患者晶状体中表达均较正常晶状体中下降，结果表明核糖体蛋白调节细胞蛋白合成和（或）介导细胞其他功能和老年性白内障的发生密切相关。

线粒体核糖体蛋白S29（mitochondrial ribosomal protein S29，MRPS29）是线粒体核糖体小亚基的一种40S 蛋白组分。 MRPs 除了构成线粒体的翻译机器之外，还具有其他的功能。 1996年，Kondoh 等[17]首次发现RPS29 能增加Krev-1 基因表达产物对恶性增殖细胞的抑制活性；Khanna 等[18]研究表明RPS29 在细胞凋亡发生过程中发挥着首要的关键作用。 唐胜建等[19]实验研究发现RPS29 基因表达产物也能抑制成纤维细胞的增殖， 并能促进成纤维细胞凋亡的发生。Cavdar Koc 等[20]研究发现与细胞凋亡密切相关的两种蛋白GTP 结合蛋白DAP3 和PDCD9 实际上是线粒体核糖体小亚基组成蛋白MRPS29 和MRPS30，进一步明确了线粒体核糖体与细胞凋亡有密切关系。Han等[21]EST 数据库的网络搜索揭示了在5′-UTR 处含有上游开放阅读框（Upstream Open Reading Frame，uORF）的MRPS29mRNA 的剪接变体的存在。 此研究中提供的数据表明MRPS29 表达受损，这是由于在荧光素酶测定和蛋白质印迹分析中显示的MRPS29 mRNA 的5′-UTR 中发现的uORF。 通过siRNA 处理减少内源性MRPS29 表达阻止HeLa 和CHO 细胞经历STS 诱导的线粒体片段化和凋亡。 进一步证实线MRPS29 是线粒体促凋亡蛋白，也称为死亡相关蛋白3（death associated protein 3，DAP3）。

本研究发现，H2O2诱导HLEC 氧化损伤的同时，也引起HLEC 内线粒体RPS29 表达的增加， 影响HLEC 线粒体蛋白合成，导致HLEC 氧化损伤和HLEC凋亡。植物雌激素GEN 能下调HLEC 内线粒体RPS29表达，抑制HLEC 凋亡，保护HLEC 氧化损伤。 因此，GEN 能有效防护H2O2诱导的HLE-B3 氧化损伤，质荷比为6532 的蛋白点可能是GEN 防护H2O2诱导的HLE-B3 氧化损伤的作用靶点，线粒体RPS29 可能是植物雌激素GEN 保护HLEC 氧化损伤的一个线粒体蛋白质。 本研究发现的植物雌激素GEN 在保护氧化损伤的HLEC 的过程中差异表达的线粒体蛋白质组作用靶点和线粒体蛋白质等线粒体蛋白质组学机制，将为进一步阐明老年性白内障的发病机制，寻求防治老年性白内障安全有效天然药物提供新的有价值的线索和科学的实验依据。