黄酒酒曲共发酵对烤烟K326烟叶品质的影响

马晓伟，申丹丹，米其利，殷沛沛，许 力，刘馨芮彤，李振杰，李晓敏, *

1.云南省烟草化学重点实验室 云南中烟工业有限责任公司技术中心 (昆明 650231) 2.红塔烟草(集团)有限责任公司 (玉溪 653100) 3.江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心 (无锡 214122)

低适用性烟叶是卷烟生产中质量较差的产品，其化学成分不协调，如淀粉、蛋白质和烟碱含量较高，致使香气欠缺、苦味重、刺激性大，目前只用于低档卷烟的配方中、或直接丢弃，严重影响经济和环境效益[1]。但低适用性烟叶中仍含有3 000多种化合物，包括糖类、氨基酸、蛋白质、有机酸及致香物质，合理开发综合利用低适用性烟叶可产生巨大的经济和环境效益[2]。将微生物资源应用于烟叶发酵是改善烟叶品质和增进烟叶香气的一项重要措施和研究热点。微生物产生的各种酶能将烟叶中的纤维素、蛋白质和糖类等大分子物质降解，形成对香气物质有贡献的小分子物质或前体物质，对烟叶的香味品质有极大的改善作用，同时还可减少发酵醇化时间、降解烟碱等有害物质[3]。

麦曲和药白曲分别是绍兴黄酒和福建红曲黄酒的重要原料之一。麦曲包括生麦曲和熟麦曲，二者均具有复杂的微生物群落，包括多种有益的产酶产香真菌和细菌种属，在黄酒发酵生产中发挥重要的作用[4]，为黄酒提供独特的风味和风味前驱物质，如1-辛烯-3-酮、4-乙烯基愈创木酚、1-辛烯-3-醇、己酸乙酯、香兰素等主要风味物质，塑造了黄酒独有的风格特征[5]。药白曲由米粉(或米糠)中加入中草药和曲母共同发酵培养而成，其微生物以根霉和酵母为主，此外还包括泛生菌属、肠杆菌属、魏斯氏菌属等，能够产生高活力的糖化型淀粉酶，可将大米中绝大部分淀粉转化成可发酵糖[6]。药白曲中的特征挥发性风味物质包括丁子香酚、草蒿脑、苯乙醇、4-乙基愈创木酚、己醛、苯甲醛、正己醇、异戊醇、2-甲酚和(±)-1-苯乙醇等[6]。

现有技术中，对烤烟加入复合酶制剂处理，在烟叶大分子物质降解、改善吸食品质方面有较大的突破，但香气改善不足[7-8]。已有研究分离筛选到芽孢杆菌等有益菌株并利用其处理烟叶，不同菌株对烟叶发酵品质改善程度不一[9-11]。基于此，本研究根据麦曲和药白曲高糖化力、特征香气的特点，将其应用于K326烤烟低适用性烟叶发酵和醇化，并检测共发酵对烟叶化学成分和致香成分的影响，为利用安全的食品酿造原料改善低适用烟叶品质、提升卷烟吸食质量、塑造新型风味卷烟等方面提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烟叶样品为2019年K326复烤片烟，产地云南，等级C4F；生麦曲和熟麦曲，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，2019年生产；药白曲，福建南平红曲黄酒酿酒厂，2019年生产；3,5-二硝基水杨酸(DNS)，国药集团化学试剂有限公司；正己烷、正丁醇、叔丁基甲醚等，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

DLEU-EBC型麦芽标准粉碎机，北京海富达科技有限公司；BSD-400型恒温恒湿培养箱，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；Agilent1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；DB-WAX型固相微萃取小柱，美国Waters公司；SCIONSQ-456-GC型气相色谱质谱联用仪GC-MS，美国Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1烟叶发酵

将K326烤烟烟叶切丝进行松散回潮；将酒曲(生麦曲、熟麦曲、药白曲)分别加入EBC粉碎机进料槽，调整刻度环，进行粗粉碎得到粒径约270 μm的酒曲；称取含水率为12 wt%的烟丝，分别与3种酒曲按质量比1∶1混合，搅拌均匀；将各烟叶酒曲混合物置于恒温30 ℃、恒湿60%条件下发酵10 d；利用50目筛子(过筛网粒子粒径不大于270 μm)分离烟叶与酒曲，得到发酵后的烟叶(KM-01，KM-02，KM-03)。将不混合酒曲发酵的K326烤烟烟叶(KM-CK)作为对照。

1.3.2感官评吸

将共发酵烟叶样品KM-01、KM-02、KM-03和对照烟叶样品KM-CK放入恒温恒湿箱(温度22 ℃±1 ℃，相对湿度60%±2%)平衡48 h后制成卷烟，请专家评吸小组(由6名专家组成)评吸。卷烟感官质量用烟草本香、香气量、香气质、浓度、刺激性、劲头、杂气、口感特性等8个指标进行评价(表1)，得分越高，抽吸品质越好。每个样品重复评吸3次。

表1 感官评分标准

1.3.3常规化学成分分析

采用DNS法、凯氏定氮法分别测定还原糖和总氮含量[12-13]；烟叶中氨基酸经酸水解提取后，利用高效液相色谱HPLC(色谱柱ODS HYPERSIL(250 × 4.6 mm, 5 μm))测定其含量[14]；参考行业标准YC/T 202—2006[15]，分别测定绿原酸、莨菪亭和芸香苷等多酚含量。

1.3.4挥发性香气物质分析

将0.5 g烟叶样品置于萃取瓶中，加入5 mL萃取液(正己烷∶叔丁基甲醚=1∶1，v/v)，在25 ℃±2 ℃ 水浴中超声30 min(60 W)，利用固相萃取小柱分离挥发性化合物。

气相色谱质谱联用条件为：色谱柱为TG-Wax型毛细管柱(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm)；程序升温为初始温度40 ℃，保持14 min，升温速率4 ℃/min，终温290 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃；进样方式splitless mode；载气为高纯氦气；恒流模式，柱流量 0.8 mL/min。质谱条件为：电离方式为电子冲击源；电离能量70 eV；离子源温度200 ℃；检测器为TSQ Quantum XLS；质量范围 33～400 amu。对采集到的质谱图利用Wiley质谱数据库库进行串联检索，确定化合物身份，并利用峰面积归一化法计算各挥发性成分在样品中的相对含量。

参照相关文献[16]，查找各成分的嗅觉阈值(Olafactory threshold)数据，以参考文献中香气物质在空气中的阈值为主，无空气中阈值的则采用水中的阈值。香气活性值(Odor activity value, OAV)为各挥发性成分的含量与其嗅觉阈值的比值，OAV ≥1的挥发性物质被认为是对烟叶香气具有贡献的重要成分[17]。

1.3.5数据分析

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，通过ANOVA评价差异显著性，利用Unscrmbler X14.0进行偏最小二乘回归分析(The Partial Least Square Regression, PLSR)，评价香气物质与感官属性间的相关性。

2 结果与讨论

2.1 感官评吸结果分析

感官评吸结果如表2所示，与对照KM-CK样品相比，共发酵烟叶样品的烟草本香、香气量、香气质均有不同程度提升，与生麦曲共发酵的KM-01样品甜感增加，鼻腔及口部稍有毛刺，口腔稍有残留和涩口；与熟麦曲共发酵的KM-02样品香气稍显粗糙、烟气有颗粒感，鼻腔稍有毛刺，稍有木质气及枯焦气，口腔稍有残留和涩口；与药白曲共发酵的KM-03样品烟气蓬松感增加，鼻腔稍有毛刺，口腔稍有残留。在总评分为100分情况下，3种共发酵烟叶的感官评分分值均增加了2分以上。

表2 各烟叶样品的感官指标得分

2.2 烟叶常规化学成分比较

烟叶化学成分是其吸食味的物质基础，自然陈化和人工发酵陈化均引起其化学成分变化已报道的外源单一菌种发酵处理后烟叶的总糖、还原糖含量均下降[11]。本研究中各处理常规化学成分含量见表3，熟麦曲处理对还原糖、总氮、蛋白质和氨基酸含量的影响较大，各成分含量均显著增加，药白曲处理则反之，生麦曲处理与对照无显著差异。

表3 烟叶样品常规成分分析 %, w/w

测定并比较不同共发酵烟叶样品中4种氨基酸的含量(图1)，与对照KM-CK样品相比，KM-02样品中4种氨基酸含量均显著增加，KM-03样品中甘氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸含量提升，KM-01样品中仅甘氨酸和脯氨酸含量增加，苯丙氨酸和半胱氨酸含量降低。张鹏等[18]将外源氨基酸(脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸)和糖类按照一定配比组合添加至烟末提取液，可显著提高糠醛、巨豆三烯酮等醛酮类香味成分含量，同时卷制的烟草薄片杂气和木质气减少，本研究中酒曲共发酵烟叶中4种关键氨基酸均有不同程度的增加。

烟叶中多酚在燃烧过程中，可裂解产生一系列具有香味的成分，是烟草香味的来源之一，一般认为，烤烟中多酚类物质的含量与其品质、芳香吃味是一致的[19]，绿原酸、芸香苷和莨菪亭是烟叶中最主要的酚类物质。多酚含量测定结果如图1b所示，与对照KM-CK样品相比，KM-02样品中绿原酸和芸香苷含量显著增加，但KM-01和KM-03样品中3种多酚含量均下降。

图1 烟叶样品中氨基酸和多酚含量的比较

2.3 致香成分分析

烟叶提取物的GC-MS分析鉴定出143种挥发性致香成分。与对照KM-CK样品相比，26种芳香族类、42种酯类、11种萜烯类、11种酮类、5种醇类、6种醛类、8种酸类、10种杂环类化合物的含量在至少一种共发酵烟叶样品中提高(表4)。

表4 共发酵烟叶中致香成分类别及含量变化

其中，增加的芳香族类化合物主要为苯乙醇、苯甲酸甲酯和苯乙酸甲酯，可增加烟气浓度和丰满度，赋予烟气甜香、花香和果香；乙酸甲酯、丁酸甲酯、己酸甲酯、壬酸甲酯、二氢甲戊酸酯、亚油酸甲酯、甲基异戊二酸酯等16 种新增的酯类化合物具有典型的花香和果香，能显著增加烟气浓度；类胡萝卜素是烟草中重要的萜烯类化合物，也是重要的香气前体物，其降解产物如香叶基丙酮和异佛尔酮含量在三种曲处理的烟叶中均增加，香叶基丙酮具有木兰花香气，应用于烟叶可显著提高其香气和口感，并去除杂气[20]，β-紫罗兰酮含量在KM-01样品中增加，具有紫罗兰香气，可赋予烟叶花香[21]，其衍生物二氢-β-紫罗兰醇在KM-01和KM-03样品中含量增加，努特卡酮呈新鲜橘香，是重要的食品香料；酮类是主要的类胡萝卜素降解产物，KM-01样品中新增加了11种酮类化合物，高于其他两种共发酵烟叶；吡啶、吡咯和吡嗪等杂环类化合物具有见过和可可的香味，可提高烟香烟味的品质，杂环类化合物，KM-01样品新增了5个呋喃和吡嗪类化合物；新增的异戊醇可赋予烟叶苹果和白兰地香味；新增的壬醛、2-甲基丁醛、异戊醛可增加烟叶脂香、可可、花香和果香，KM-01样品还增加了另外3种具有果香和肉香的醛类化合物。

基于香气活性分析，发现含量增加的致香成分中，11种芳香类、8种酯类、3种萜烯类、1种杂环类、1种醇类、2种醛类化合物的OAV大于1(表5)，可能为酒曲共发酵烟叶的关键香气成分，可用于表征其香气风格特征。其中愈创木酚、苯甲酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯分别为KM-01、KM-02、KM-03样品中OAV值最大的致香成分，可分别赋予烟叶花香、花香和樱桃、苹果和朗姆酒香，这也与3种烟叶的感官特征指标相吻合。

表5 共发酵烟叶中OAV≥1的关键致香成分

2.4 香气物质与感官评吸属性相关性分析

利用偏最小二乘回归分析(PLSR)分析了香气物质与感官评吸属性之间的相关性(如图2所示)，双因素模型解释了X(香气化合物)和Y(感官属性)中42%的方差。内部椭圆圈表示50%的解释方差，外部椭圆圈是单位圆，表示100%的解释方差；位于两个椭圆之间的香气化合物可被视为与感官属性相关，而位于内部椭圆的香气化合物则被视为与感官属性关系不大，共有6个Y变量和65个X变量位于内外椭圆之间，表明它们可由PLSR模型解释。干净度、香气量、湿润感和烟草本香位于右上象限，与39种香气化合物相关，其中大多数为酯类和酮类。与熟麦曲共发酵的KM-02样品与香气量、湿润感和烟草本香的感官属性高度相关，与之相关的香气化合物包括4-乙基愈创木酚、苯乙醛、苯甲醛、2-苯乙酰乙酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯乙醇、壬醛、香叶基丙酮、努特卡酮、4-氧异膦酮、5-甲基糠醛、丁内酯等。与药白曲共发酵的KM-03样品与干净度的感官属性高度相关，与之相关的香气化合物包括与巴豆酸甲酯、乙酸2-甲基丁酯、苯乙酸甲酯、亚油酸甲酯、烟酸甲酯、γ-戊内酯和二氢-β-紫罗兰醇等。对照KM-CK样品表现出强烈的刺激性香气。尽管与生麦曲共发酵的KM-01样品总感官得分最高，但它与任何感官属性都不相关。

注：黑色圆点.香气物质；红色圆点.感官属性；黑色方框.烟草样品。

3 结论

本研究利用用于黄酒风味物质形成的酒曲作为共发酵剂，通过酒曲中复合微生物的作用，提升低适用性烟叶感官吸食品质，处理后的烟叶香气量及丰富性增加，香气协调性提高，甜感增加，香气质更细腻圆润，感官评分得到不同程度提升。熟麦曲共发酵对对还原糖、氨基酸和多酚等化学成分的含量提升具有显著效果，生麦曲和药白曲处理的烟叶中致香成分的种类和含量均得到了大幅提升，药白曲共发酵烟叶获得了更多新的致香成分，因此其香气质、香气量、香气协调性均较好，具有进一步开发特色烟叶的潜力。愈创木酚、苯甲酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯分别为3种共发酵烟叶样品中香气活性值最大的致香成分，可分别赋予烟叶花香、花香和樱桃、苹果和朗姆酒香，这也与三种烟叶的感官特征指标相吻合。三种曲中不同微生物的组成及其生化活动，是引起这些常规化学成分和致香成分的变化及差异的主要原因。由于黄酒酒曲的食用安全性，利用其提升低适用性烟叶品质，提高其利用率潜力巨大。